探讨HNF-1α与mGLUT1的表达调节过程的相互关系

　　I型葡萄糖载体(mGLUT1)在各种组织中分布比较广范,主要参与葡萄糖的主动吸收过程和其他能量物质的代谢过程.mGLUT1表达水平在癌症、缺氧及炎症等多种病理状态下有较明显的增高.HNF-1α在肝细胞和胰腺β细胞中高表达,参与体内葡萄糖及脂肪代谢的调节过程.HNF-1α是细胞中肝细胞核因子(HNF)的一个亚型,是一种转录调节因子,在转录水平参与包括葡萄糖激酶在内的多种蛋白质的表达过程.

　　本实验为了探讨HNF-1α与mGLUT1的表达调节过程的相互关系,应用DNA重组技术组建了HNF-1α的蛋白质表达质粒,将重组HNF-1α表达质粒按照时间和剂量梯度瞬间转染CV-1细胞,应用RNA印迹法检测mGLUT。1mR-NA的表达和稳定性实验结果表明,mGLUT1、mRNA的表达和稳定性在HNF-1α存在的条件下有明显的增强.

　　1、材料和方法

　　1.1材料

　　CV-1细胞株(ATCC);Dulbecco’smodifiedEagle’s培养液(DMEM,Life Technologies,Gaithersburg,MD,美国);DNA提取层析柱(Qiagen,Hilden,Germany);pCRⅡ-TOPO载体(Life Technolo-gies,Gaithersburg,MD,美国);OPTI-MENⅠ(Life Technologies,Gaithersburg,MD,美国);Lipo-fectAMINEPLUS试剂(Life Technologies,Gaithers-burg,MD,美国);裂解缓冲液(Promega,Madison,WI,美国);TRIzol试剂(LifeTechnologies,Gaith-ersburg,MD,美国).

　　1.2方法

　　1.2.1重组体的构建

　　利用PCR扩增将HNF-1αcDNA扩增,扩增片段插入到pCRⅡ-TOPO载体.用内切酶KpnⅠ/EcoRⅠ内切cDNA后,将酶切片段亚克隆到KpnⅠ/EcoRⅠ酶切的pSV-sport载体上,组建重组体pSV-sportHNF-1α.应用Sanger法确定重组体的DNA碱基序列.

　　1.2.2重组体瞬间转染

　　将重组DNA转染到大肠杆菌感受态细胞后,在TB培养液中培养8h,利用层析柱提取纯化.按照细胞密度1×106个细胞/孔培养CV-1细胞,经过20h培养吸附后,将重组DNA利用Lipofect AMINEPLUS试剂转染CV-1细胞.转染细胞继续培养18h,利用TRIzol试剂提取RNA.

　　1.2.3Northern、blot

　　用上述方法将HNF-1α转染CV-1细胞后,转染细胞继续培养18h,利用TRIzol试剂提取总RNA.20μg总RNA在含有5%(质量分数)甲醛的1%(质量分数)变性琼脂糖中进行电泳,然后将RNA转移到尼龙膜上并UV交联.尼龙膜在杂交缓冲液中进行预杂交,然后在65℃下与mGLUT1探针进行杂交2h.杂交完毕后尼龙膜在37℃下用2xSSC,0.1%(质量分数)SDS(高盐洗液)进行15min2次冲洗,然后用0.2xSSc,0.1%(质量分数)SDS(低盐洗液)冲洗.冲洗后将尼龙膜放置在胶片下,-70℃条件下过夜.将18S和28SRNA作为对照.

　　1.2.4统计学分析

　　采用SPSS17.0统计软件进行数据分析.计量资料的数据以均数±标准偏差(x珚±SD)表示,进行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义.

　　2、结果

　　2.1在CV-1细胞中HNF-1α可增强　mGLUT1　mRNA表达

　　为确定在体内条件下HNF-1α是否可以调节mGLUT1 mRNA的表达,进行了剂量梯度组Northernblot,结果表明在体内条件下CV-1细胞中HNF-1α可增强mGLUT1mRNA的表达(图1).

　　2.2在CV-1细胞中HNF-1α可增强mGLUT1 mRNA表达的稳定性

　　为确定在体内条件下HNF-1α是否可调节mGLUT1mRNA表达的稳定性,进行了时间梯度组Northernblot,结果表明在体内条件下CV-1细胞中HNF-1α可增强mGLUT1mRNA表达的稳定性(图2).

　　3、讨论

　　肝细胞核因子在肝细胞和胰腺β细胞中高表达,是这些组织中某些靶基因表达的重要的转录调节因子,其中HNF-1主要在肝细胞中表达.HNF-1α作为HNF-1的一个亚型可与GGTTAAT-NATTA(A/C)Ca相关联的序列结合,对某些基因的表达具有重要的调控作用.

　　研究结果表明,HNF-1的表达可参与胰岛素介导的糖、脂代谢相关基因的表达调控.mGLUT1参与体内葡萄糖水平的调控,而GLUT1基因的mRNA稳定性较差,这种结构的不稳定性是由GLUT1mRNA的3′末端的多聚腺苷尾(3′-UTR)结构决定的,这种末端结构可以和多种蛋白质结合后影响mGLUT1mRNA的稳定性,即促进其mRNA的降解,因此这种结构降低mGLUT1的蛋白质表达.据报道,经胰岛素处理后的3T3-L1脂肪细胞和L6肌肉细胞可以增加mGLUT1的表达水平.

　　另有研究结果表明,在动物糖尿病模型和糖尿病患者的组织样品中mGLUT1的蛋白质表达不明显,但是经过处理胰岛素后mGLUT1mRNA的表达水平有明显的提高.这些实验结果表明,经过胰岛素处理后的mGLUT1mRNA表达水平的增强有可能与mGLUT1基因和胰岛素或其传导通路中的某些蛋白因子的相互作用有关.综上分析,可以推测HNF-1α蛋白质可能间接或直接影响mGLUT1的蛋白质表达调节过程.

　　本实验结果表明,mGLUT1mRNA表达水平在HNF-1α蛋白质存在的条件下可增高,且表达稳定性增强.

　　总之,HNF-1α可能通过促进mGLUT1的表达参与胰岛素介导的对mGLUT1的表达调节,在转录调节水平参与体内葡萄糖代谢的调节.

　　参考文献：
　　[1]McPherson CE,Shelton EY,Friedman DS,et al..Anactive tissue-specific enhancer and bound transcriptionfactors existing in a precisely positioned nucleosomal ar-ray[J].Cell,1993,75:387-398.
　　[2]Lai E,Prezioso VR,Tao WF,et al..Hepatocyte nucle-ar factor 3 belong to a gene family in mammals that ishomologous to the Drosophila homeotic gene forkhead[J].Genes Dev,1991,5:416-427.
　　[3]Song YH,RayK,Liebhaber SA,et al..VitaminD-binding protein gene transcription is regulated by therelative abandance of hepatocyte nuclear factors 1αand1β[J].J Biol Chem,1998,264:28408-28418.
　　[4]Miura N,Tanaka K.Analysis of the rat hepatocyte nu-clear factor(HNF)1 gene promoter:synergistic activa-tion by HNF4 and HNF1 proteins[J].Nucleic Acids Res,1993,21:3731-3736.
　　[5]Wang H,Maechler P,Hagenfeldt KA,et al..Domi-nant-negative suppression of HNF1αfunction results indefective insulin gene transcription and impaired me-tabolisom-secretion coupling in a pancreaticβ-cell line[J].EMBO J,1998,17:6701-6713.
　　[6]Chen QI,PhillipH,Pekala.The influence of mRNAstabilityon glucose transporter(GLUT1)gene expres-sion[J].BBRC,1999,263:265-269.
　　[7]Yoko O,Masahiro S,Toshiya Y.Involement of nucleartranscription factor Sp1 in regulating glucose transporter-1 gene expression during rat trophoblast differentiation[J].BBRC,2001,288:940-948.
　　[8]Flores-Riveros JR,McClenithan JC,Ezaki O,et al..Insulin down-regulates expression of the insulin-respon-sive glucose transporter(GLUT4)gene:effects on tran-scription and mRNA turnover[J].Proc Natl Acad SciUSA,1993,90:512-516.
　　[9]Pai J,Guryev O,Brown MS,et al..Differential stim-ulation of cholesterol and unsaturated fatty acid biosyn-thesis in cells expressing individual nuclear sterol regula-toryelement-binding proteins[J].
J Biol Chem,1998,273:26138-26148.
　　[10]Pardridge WM,Triguero D,Farrell CR.Down regula-tion of blood-brain glucose transporter in experimentaldiabetes[J].Diabetes,1990,39:1040-1044.
　　[11]Lutz A,Pardridge WM.Insulin normalizes GLUT1 glu-cose transporter mRNA but not immunoreactive trans-porter protein in streptozotocin-diabetic rats[J].Metabo-lism,1993,42:939-944