我国是养猪大国, 养猪业在国民经济中居于十分重要的地位。但猪圆环病毒病、猪瘟、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎等病毒性疫病已成为当前困扰养猪业发展的重大问题, 每年因病毒感染而造成的损失无法估量。对这些常见的病毒病, 虽然有些可用疫苗作常规免疫, 但由于免疫程序、疫苗本身和动物个体等原因, 使其在实际应用中的效果并不十分理想。干扰素 (interferon, INF) 是由细胞产生的一类具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的蛋白质, 是目前应用前景较为广阔的生物制剂之一。猪干扰素可分为!、"、#、$、%等几个型, 其中!、"、$、%等属I型干扰素, #属II型干扰素。研究表明, 猪干扰素!对伪狂犬病毒[1]、传染性胃肠炎病毒[2,3]、猪瘟病毒[4]、猪呼吸与繁殖综合症病毒[5,6,7,8,9,10,11,12]和口蹄疫病毒[13,14,15,16]等均具有较好的抗病毒作用。另外, 近年来的研究发现, 猪干扰素!对口蹄疫病毒表位疫苗[17,18]、口蹄疫病毒VP1亚单位疫苗[19]等基因工程疫苗均具有免疫佐剂作用, 并对猪口蹄疫[13,14,15,20]和猪传染性胃肠炎等多种病毒性传染病都有一定的防治效果。国家各部委对猪干扰素!的研究也从不同的途径给予了支持, 如“十五”国家重大专项科技攻关计划课题 (2002BA514A2-2) 、国家“十一五”科技支撑计划专项 (2006BAD06A08) 、国家重点基础研究发展计划 (973) 项目 (2006CB504401) 、国家“863”计划资助项目 (2002AA245071) 和国家行业专项子课题 (200803020-4) 等。
1 猪干扰素!的分子结构
猪干扰素!主要由淋巴细胞产生, 有多个亚型, 其抗病毒作用最广、效果最显著。1986年LEFE-VRE等[21]首先从猪的基因组文库中克隆出了10个潜在的猪干扰素!基因, 并在大肠杆菌中表达出猪干扰素!1, 不过表达量较低。猪干扰素!基因无内含子, 编码189个氨基酸, 前23个氨基酸为信号肽, 后166个氨基酸为成熟活性蛋白。成熟猪干扰素!的70~80位氨基酸有1个潜在的N-糖基化位点, 在1~99位、29~139位之间形成2个二硫键, 其中29~139位之间的二硫键对于IFN的生物学活性更为重要。与HuIFN-!l核苷酸序列的同源性为78.5%, 氨基酸同源性为64%。YERLE等[22]发现猪干扰素!基因位于1号染色体上。CHENG等[23]从猪的基因组中鉴别出了14个猪干扰素!基因。
2 猪干扰素!基因工程
临床上, 猪干扰素!对病毒性疾病具有较好的防治效果。现在虽已有商品化的兽用干扰素上市, 但这些干扰素主要是由特定的诱导剂诱导产生的, 制备工艺复杂, 产量低, 成本高。WEINGARTL等[24]优化了应用NDV诱导猪外周血淋巴细胞生产猪白细胞干扰素的条件, 发现当外周血淋巴细胞的浓度为9.6×106个/mL, 先用64U/mL猪干扰素!孵育18h后再用4 915HAU/mL NDV诱导24h, 最高可获得12 800U/mL猪白细胞干扰素。1990年LEFEVRE等[25]构建了pLD67MetIFN-!1&HS/CAGl139表达系统, 在大肠杆菌中表达出重组的成熟猪干扰素!1 (rIFN-!1) , 在MDBK细胞上抗VSV病毒活性达5×107~10×107 IU/mg, rIFN-!1的抗病毒活性是病毒诱导的白细胞干扰素的6倍。因此, 利用基因工程技术生产重组猪干扰素!是可行的, 对基础研究和应用研究均具有重要的意义。
近年来, 国内应用基因工程技术表达猪干扰素!的报道逐渐增多。
2.1 猪干扰素!在大肠杆菌表达系统中的表达
21世纪以来, 国内许多学者进行了利用大肠杆菌表达系统表达猪!干扰素的研究, 获得的目标蛋白质要么表达量低, 要么以包涵体形式表达, 需要经变性、复性等繁杂的操作, 难以适应规模化生产和应用的需要。如陈涛等[26]构建了pGEX-IFN/BL21表达系统, 将以包涵体形式表达的目的蛋白经变性、复性处理, 再经FPLC进一步纯化, 得到的重组猪干扰素!的活性为5 200IU/mg。吴丹等[4,27]构建了pQE30/PoIFN!/JM109表达系统, 表达的rPoIFN-!N端含6个组氨酸标签, 相对分子质量2.07×104, 以包涵体形式存在, 经部分纯化并充分复性后, 在MDBK细胞上抗滤泡性口炎病毒 (VSV) 的活性高达1×108 IU/mL, 103和105 IU的rPoIFN-!在PK-15细胞上有效抑制猪瘟病毒 (HCV) 石门系 (SM) 强毒的感染。曹瑞兵等[28]构建了pCIFNA/DH5!表达系统, 表达产物以包涵体形式存在, 用含6mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理, 复性后的表达产物经凝胶层析纯化, 在MDBK/VSV系统上的抗病毒活性约为1.66×106 U/mg。曹瑞兵等[29]为了获得poIFN-!1高表达, 使用了大肠杆菌的偏爱密码子, 人工合成了poIFN-!1成熟蛋白编码基因。利用合成的poIFN-!1成熟蛋白编码基因构建pRLC/DH5!表达系统。表达产物以包涵体形式存在, 包涵体经变性、复性和纯化获得的重组poIFN-!1在MDBK/VSV系统上的抗病毒活性约为6.4×106 U/mg。谢海燕等[30]将猪干扰素!的基因亚克隆到原核表达载体pET-28a, 构建了重组表达质粒pE-TIFN-!。经过SDS-PAGE蛋白质电泳, 测得表达蛋白的相对分子质量约为2.65×104, 其抗病毒活性不详。XIA等[4]构建pQE30/PoIFN-!c/M15 (pREP4) 表达系统, 表达的rPoIFN-!以包涵体形式存在, 经部分纯化并充分复性后, 用细胞病变抑制法测定rPoIFN-!在MDBK细胞上抗滤泡性口炎病毒 (VSV) 活性达1×108 IU/mL。
刘占通等[31,32,33]构建了PGEX-4T-1/BL21表达系统, 表达产物N-端带GST融合蛋白, 且以包涵体形式存在, 经变性、复性处理后, 在Veor细胞上抗VSV的活性为2.24×103 U/mg。另构建了pET-43.1a-C (+) /BL21表达系统, 表达的融合蛋白以可溶性形式存在。表达产物约占菌体总蛋白的29.8%。李文辉等[34]全基因合成得到编码野猪干扰素!成熟肽的基因, 构建了pWL/DH5!表达系统, 重组野猪IFN!表达量大于25%。复性纯化后重组蛋白在WISH/VSV上的活性为4.45×106 IU/mg。闫若潜等[35]构建了pQE30/PolFN-!/JM109表达系统, 表达的融合重组猪干扰素!蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化, 蛋白纯度在95%以上, 纯化的rPoIFN-!蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.448 2×104 IU/mL (5.2×106 IU/mg) , 在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-!蛋白最低有效剂量为640 U/mL (2.3×104 U/mg) 。陈雪梅等[36]构建了pET-His/PoIFN-!/Rosetta (DE3) 表达系统, 表达产物经包涵体洗涤、过柱纯化后, 蛋白纯度能达90%以上。在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上的抗病毒活性分别为2.46×107 U/mg、4.32×105 U/mg、8.45×105 U/mg、2.45×105 U/mg、2.68×107 U/mg。高明等[37]采用RT-PCR从猪脾淋巴细胞中扩增出猪IFN!基因, 以pPROExHTa为载体构建了表达重组质粒, 转化宿主菌BL21, 经IPTG诱导获得了表达。该重组蛋白以包涵体形式存在, 采用Ni-Ni金属螯合亲和层析方法纯化, 其纯度达到80%以上, 包涵体经复性后, 在WISH/VSV系统上, 其稀释度小于1∶103时才有抗病毒活性。贾自文等[38]构建了pET28-PolFN-!/BL21表达系统, 表达产物主要以包涵体形式存在, 纯化后的目的蛋白纯度约为90%, 其活性约为1.67×106 U/mg。
夏俊保等[39]提取猪肝脏细胞基因组DNA, PCR扩增猪干扰素! (PoIFN-!) 基因, 克隆到pGEX-5X-1载体上, 转化入E.coli BL21, GST亲和层析纯化, Hep-2/VSV系统上滴定效价。结果带有GST标记的rpoIFN-!能高效表达, 该rPoIFN-!在Hep-2/VSV系统上的抗病毒活性为1.1×107 IU/mg。宋振威等[40]以蛋白质自切割元件内含肽 (Intein) 替代蛋白酶, 并以细菌自身产生的聚羟基丁酸酯 (PHB) 颗粒替代亲和配基, 构建了新型内含肽介导PHB的PoIFN-!表达和纯化体系, 当诱导自切割反应温度为20℃、pH=6.5、反应时间为24~36h时, 可以实现内含肽C端高效自切割, 纯化出的PoIFN-!产量为20~30 mg/L。万博等[41]扩增猪干扰素!基因, 克隆至原核表达载体pET-28a中, 构建原核表达载体pET-IFN-!, 将pET-IFN-!转化至BL21进行表达。表达的猪!干扰素在PAM细胞上抗PRRSV活性为1.13×106 U/mg。杨永胜等[42]根据猪干扰素!1 (PoIFN-!1) 的全基因序列 (EU364896) 设计合成1对特异引物, 通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-!1全基因, 将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中, 构建重组表达载体pGEX-6P-poIFN-!1, 转化大肠杆菌BL21 (DE3) , 可表达相对分子质量约4.6×104的融合蛋白 (GST-PoIFN-!1) , 目的蛋白以包涵体形式表达。赵伟鸽等[43]构建pET-30-IFN-!/BL21表达系统, 表达产物主要以包涵体形式存在, 包涵体蛋白经变性、复性后, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化, 获得高纯度重组猪IFN-!, 抗星状病毒复制的活性为3.15×103 U/mg。闫丽辉等[44]将猪干扰素!克隆入原核表达载体pPROExHTa, 转化BL21, IPTG诱导表达, 表达产物主要以包涵体的形式存在, 包涵体经变性、复性, 其活性为2 900IU/mg。郑鸣等[45]构建了pET30a/BL21 (DE3) 表达系统, 以N-十二烷基肌氨酸钠 (SKL) 作为变性剂, 包涵体变性溶解后采用稀释法进行复性。在Marc-145抗PRRSV和VSV的活性分别为11.3×106U/mg和2.35×106 U/mg, 在PK-15细胞上, 抗PRRSV和VSV的活性分别为18.2×106 U/mg和4.31×106 U/mg。最近我们单位构建了一套新的大肠杆菌表达系统, 实现了猪IFN-!在大肠杆菌的高水平可溶表达, 经亲和层析一步法纯化, 其纯度达到90%以上, 纯化出的PoIFN-!产量为100mg/L, 在PK-15/VSV系统上的抗病毒活性约为1.0×108 U/mg, 其产量和抗病毒活性均高于现有报道, 为其产业化生产和应用奠定了基础。
2.2 猪干扰素!在酵母表达系统中的表达
黄海等[46]将猪干扰素! (PoIFN-!) 基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ!A中, 电转化毕赤酵母KM71H菌株, 抗生素zeocin浓度梯度筛选高抗性转化子, 以PCR鉴定阳性重组菌株, 用甲醇诱导表达。表达量为0.45mg/mL, 经WISH/VSV检测表达产物的抗病毒活性为5.6×104 IU/mg。葛丽等[47]将猪干扰素!基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ!A中, 电转化毕赤酵母KM71H菌株, 以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基, 用甲醇诱导表达SDS-PAGE和Western blot印迹杂交结果证实, 表达产物为重组PoIFN-!融合蛋白, 经细胞毒性试验检测 (WISH/VSV系统) , 表达产物的抗病毒活性为4.1×106 IU/mL。姚清侠等[48]将编码梅山猪干扰素!成熟蛋白基因 (mPoIFN-!, 501bp) 亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中, 构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-!。转化入毕赤酵母菌株GS115, 表达产物相对分子质量约为2.0×104, 在GS115中的表达量约为40mg/L, 占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现, 重组酵母菌表达的蛋白耐酸 (pH 2) , 对热 (56℃) 部分敏感, 并能被特异性抗猪干扰素!抗体中和而不与抗猪干扰素#抗体反应。rPoIFN-!在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。
张存等[49]将PCR扩增的PoIFN-!基因插入pPIC9k, 构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFN-!, 电转化毕赤酵母GS115菌株, 重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白, 表达量达136mg/L。表达产物经过SP-Sepharose阳离子交换层析, 可以得到纯度较高的rPoIFN-!, 纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。张蕾等[50]用RT-PCR方法获得猪干扰素!基因, 将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接, 并电转入毕赤酵母GS115菌中, 经甲醇诱导表达后, SDS PAGE电泳检测IFN-!蛋白表达相对分子质量约为1.9×104的蛋白质。刘健等[51]根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性, 将去除信号肽的猪干扰素! (PoIFN-!) 基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列, 置于毕赤酵母菌!因子分泌信号的DNA序列后, 构建成pPICZAC-PoIFN-!分泌型重组表达载体, 电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中, 经Zeocin TM抗性筛选后获得大量多拷贝重组子, 所获得的重组子能够分泌表达出相对分子质量约为1.9×104的PoIFN-!特异蛋白, 其有效蛋白表达量较高, 达54.105mg/L。经Vero-VSV系统测定PoIFN-!效价达到5.87×107 U/L。
2.3 猪干扰素!在其它表达系统中的表达
王彦彬等[52]应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统, 将编码猪干扰素α和γ成熟蛋白基因插入供体质粒pFastBacDual, 分别置于PH和P10启动子控制下, 引入蜂素信号肽 (honeybee melittin signal peptide, HBM) 基因取代猪干扰素α和γ原有信号肽基因以实现分泌型表达, 并在C端分别融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组, 获得重组穿梭质粒Bacmid, 转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染昆虫细胞, 猪干扰素α和γ重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中均获得表达, 表达产物主要分布在培养上清液中。通过在猪肾细胞 (PK-15) 上抑制水泡性口炎病毒 (VSV) 致病变作用检测, 昆虫细胞上清的抗病毒效价达到3.24×107 U/mL。在Marc-145细胞, 昆虫细胞上清液经2-11稀释能够抑制100个TCID50的PRRSV的致细胞病变作用。
3 猪干扰素!的应用研究
3.1 作为抗病毒制剂在猪病毒病防治上的应用
CUMMINS等[53]在猪群暴发TGE时, 将1~12日龄的仔猪分为4组, 分别连续4d口服0、1、10、20IU的nHuIFN-!, 结果口服干扰素仔猪的存活率明显高于对照组。CHINSANGARAM等[13]构建了表达猪干扰素!的重组腺病毒, 给猪接种109PFU重组腺病毒, 24h后用FMDV强毒攻击, 试验猪没有临床症状和病毒血症, 也没有检测到针对FMDV非结构蛋白的抗体, 获得完全保护。岑路等[54]采用毕赤酵母表达系统表达的猪干扰素!发酵工艺中试产品, 按照农业部颁布的《高致病性猪繁殖与呼吸综合征防治技术规范》进行治疗病毒性猪“高热病”临床观察, 对确诊为高致病性PRRS的病猪随机选出病程较重的8头作为治疗试验组, 其余2头症状较轻的设为对照组。试验组干扰素的用量5mL/ (头·d) , 颈部肌肉注射, 连用6d。此外, 与对照组相同的方法和剂量使用抗菌素等配合治疗药物。对照组颈部肌肉注射10%恩诺沙星注射液5mL/ (头·d) , 外加头孢金方、阿莫西林粉拌料和强力拜固舒饮水, 连用6d。对照组与治疗组效果差异显著, 试验组治愈率达87.5%。岑路等[54]对确诊为高致病性PRRS的病猪随机仔猪分成3组, 猪干扰素! (l.37×109 IU/mL) 的用量分别为0.5、1.0、1.5mL/ (头·d) , 颈部肌肉注射, 连用3~6d;成猪也分成3组, 干扰素的用量分别为1.0、1.5、2.0mL/ (头·d) , 颈部肌肉注射, 连用3~6d。同时采用与对照组相同的方法和剂量使用抗菌素。平均治愈率在81%以上。
熊忠良等[55]以武汉市和江汉平原2个规模猪场发生猪瘟、猪蓝耳病等病毒性传染病为对象, 用猪基因工程复合干扰素配合常规药物进行了预防和治疗效果试验。治疗试验选择临床发病猪进行疗效观察, A猪场选用196头发病仔猪肌注噻呋孢王和黄芪多糖注射液, 用量分别为40~50 mg/kg体重和3~5mL/头, 连用3~5d, 同时肌注猪基因工程复合干扰素2mL/头, 1次/d, 连用3d;B猪场选用324头发病仔猪肌注氟力佳和黄芪多糖注射液, 用量分别为0.1mL/kg体重和3~5mL/头, 连用3~5 d同时肌注猪基因工程复合干扰素2mL/头, 1次/d, 连用3d;A、B两猪场分别设对照组, 对照组不注射猪干扰素, 其他治疗情况相同, 记录病猪死亡及康复情况。预防试验分别随机选择各猪场未发病哺乳仔猪, 肌注猪干扰素3~4次, 2mL/头, 每7~8d预防注射1次, 对照组不注射猪干扰素, 统计发病及成活仔猪数, 试验组和对照组的免疫和保健均正常进行。结果干扰素配合常规兽药治疗总有效率分别为87.2%、84.6%, 与对照组总有效率29.15%、26.1%相比较, 差异极显著 (P<0.01) ;干扰素对病毒性疾病预防试验仔猪成活率分别为95.8%、93.6%, 与对照组成活率54.7%、68.1%相比较, 差异极显著 (P<0.01) 。
岑路等[56]选择广东四会某猪场40头断奶仔猪为观察对象, 按试验要求随机分成3个组, 取平均体重8.39kg的14头为对照组, 另外平均体重为6.85和7.04kg的各13头分别为试验1、2组。购进供试验断奶仔猪, 第2天上午试验组分别按试验1组为1 mL/头 (≥8.3×106 IU/kg) 、试验2组为2mL/头 (≥1.6×107 IU/kg) 肌肉注射PoIFN-!注射液。试验观察35d。试验1、2组与对照组相比较料重比分别降低6.3和17.23百分点, 平均日增重率分别改变了3.69和24.85百分点, 成活率分别提高了6.6和14.3百分点, 腹泻率分别降低了11.5和26.9百分点, 疾病总防治率分别提高了40.1和55.49百分点;试验观察期间, 对照组诊断为蓝耳病的4例, 死亡1例, 试验组则没有发生蓝耳病例。表明猪干扰素!对仔猪的生长有良好的促进作用, 具有显著的紧急预防病毒性疾病效果。崔尚金等[57]利用腺病毒表达系统表达猪干扰素!, 含有干扰素不低于1 000万U/mL, 5mL/瓶, 5 000万U/瓶。使用方法是肌肉注射。体重≤50kg, 0.5 mL/头;体重50kg以上, 1.0mL/头。注射1次/ (头·d) ;病重者可注射2次/d, 连续3~5d。对临床发生口蹄疫、蓝耳病等病毒病的猪群具有明显的治疗效果, 没用干扰素治疗的死亡率高、治愈率低、发病持续期长。
王丹[58]利用PET32a/BL21表达系统表达了猪!干扰素, 在Marc-145细胞上测定重组猪干扰素!抗PRRSV的病毒活性为5.0×103 U/mg。将经过实验室确诊为猪圆环病毒、蓝耳病毒和副猪嗜血杆菌混合感染的20头猪进行隔离, 随机分成2组, 10头/组, 第1组用干扰素颈部肌肉注射, 10U/kg, 对症治疗用5%葡萄糖、新型蓝圆伪散 (主要成分:黄芪、天花粉、败酱草、板蓝根、云芝多糖) 拌料, 拉稀应激康饮水, 严重的肌肉注射碧血剑;第2组只用以上药物进行治疗, 不用干扰素注射。第1组发病猪处方效果十分理想, 用药第1d, 精神食欲明显好转, 第3天精神、食欲、体温基本恢复正常, 第5天除有1头猪病情较重不食, 治疗的第3天死亡外, 其余9头均康复, 疗效90%。第2组用药2d, 有7头猪精神、食欲、体温好转, 但仍有3头猪精神差, 连续用药5d, 停药后仍有2头猪复发, 又采用头孢噻呋钠 (哈药集团兽药厂) 0.5g/头, 肌肉注射, 1次/d, 连用5d, 死淘3头, 其余7头康复。以上报道说明, 猪干扰素!对猪传染性胃肠炎、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟等病毒性疾病具有较好的防治效果, 值得推广。
3.2 作为免疫佐剂, 在新型基因工程疫苗上的应用
CHENG等[17]研究了猪干扰素!对猪口蹄疫重组蛋白疫苗IgG-FMDV的免疫佐剂作用。IgG-FMDV包含猪免疫球蛋白重链恒定区和O型口蹄疫的抗原肽。结果表明猪干扰素!联合猪口蹄疫重组蛋白疫苗IgG-FMDV组产生中和抗体的速度快, 水平也明显提高, 对强毒攻击可提供完全保护, 显示出显著的佐剂效应。曹瑞兵等[59]将酵母表达的PCV2Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪干扰素!制成亚单位疫苗。30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪干扰素!佐剂亚单位疫苗, 同时设攻毒对照与空白对照, 首免后21d加强免疫, 二免后14d用PCV2JS株攻毒。猪干扰素!佐剂亚单位疫苗组仔猪免疫后产生的ELISA抗体和中和抗体都显著高于铝胶亚单位疫苗组仔猪。攻毒对照组的4头仔猪攻毒后全都产生了病毒血症, 并有较长时间的发热;铝胶亚单位疫苗组4头仔猪中只有1头仔猪产生病毒血症, 添加猪干扰素!亚单位疫苗组的仔猪攻毒后都没有产生病毒血症。综合分析试验猪的病毒感染、临床表现和生产性能等情况, 表明Cap蛋白亚单位疫苗具有免疫保护效果, 猪干扰素!可显著增强Cap蛋白亚单位疫苗接种仔猪的体液免疫反应, 提高PCV-2Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护效果。
4 前景展望
在当前我国病原变异株不断出现, 混合或继发感染已成常态, 临床猪病越来越难防治的形势下, 急需寻求一种高效、安全以及无毒副作用的畜禽疾病防治新技术、新方法和新产品。大量研究表明, 猪干扰素!是一种具有广阔应用前景的抗病毒药物。目前市场上使用最多的是猪白细胞干扰素, 由四川世红生物技术有限公司通过诱生方法生产, 于1997年获得农业部新兽药证书[ (97) 新兽药证字第01号]。至今尚未有基因工程重组的猪干扰素!获得新兽药证书, 也未有进口的猪干扰素!获得进口注册证书。猪干扰素!生产成本高昂一直是干扰素在兽医临床上应用的最大障碍。但随着人们对猪干扰素!基因工程技术研究的不断深入, 人们将会开发出价格低廉、疗效好的基因工程猪干扰素!。2014年安徽九川生物科技有限公司申报的重组猪干扰素! (冻干型) 获得临床试验批文 (2014042) , 2017年肇庆大华农生物药品有限公司等单位申报的基因工程猪!干扰素获得临床试验批文 (20170011) 。随着这些基因工程猪干扰素!的上市, 猪病毒病的防控必将带来新的变化。
参考文献
[1]POL J M, BROEKHUYSEN-DAVIES J M, WA-GENAAR F, et al.The influence of porcine recombinant interferon-alpha 1on pseudorabies virus infection of porcine nasal mucosa in vitro[J].Journal of General Virology, 1991, 72 (Pt4) :933-938.
[2]JORDAN L T, DERBYSHIRE J B.Antiviral activity of interferon against transmissible gastroenteritis virus in cell culture and ligated intestinal segments in neonatal pigs[J].Veterinary Microbiology, 1994, 38 (3) :263-276.
[3]JORDAN L T, DERBYSHIRE J B.Antiviral action of interferon-alpha against porcine Transmissible gastroenteritis virus[J].Veterinary Microbiology, 1995, 45 (1) :59-70.
[4]XIA C, DAN W, WEN-XUE W, et al.Cloning and expression of interferon-alpha/gamma from a domestic porcine breed and its effect on classical swine fever virus[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 2005, 104 (1) :81-89.
[5]ALBINA E, CARRAT C, CHARLEY B.Interferon-alpha response to swine arterivirus (PoAV) , the porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Journal of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18 (7) :485-490.
[6]BUDDAERT W, VAN R K, PENSAERT M.In vivo and in vitro interferon (IFN) studies with the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) [J].Advances in Experimental Medicine and Biology, 1998, 440:461-467.
[7]LEE S M, SCHOMMER S K, KLEIBOEKER S B.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates differ in in vitro interferon phenotypes[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 2004, 102:217-231.
[8]CHANG H W, JENG C R, LIU J J, et al.Reduction of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in swine alveolar macrophages by porcine circovirus 2 (PCV2) -induced interferon-alpha[J].Veterinary Microbiology, 2005, 108 (3) :167-177.
[9]BROCKMEIER S L, LAGER K M, GRUBMAN M J, et al.Adenovirus-mediated expression of interferon-alpha delays viral replication and reduces disease signs in swine challenged with porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Viral Immunology, 2009, 22 (3) :173-180.
[10]LUO R, FANG L, JIN H, et al.Antiviral activity of type I and type III interferons against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) [J].Antiviral Research, 2011, 91 (2) :99-101.
[11]BROCKMEIER S L, LOVING C L, NELSON E A, et al.The presence of alpha interferon at the time of infection alters the innate and adaptive immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Clinical and Vaccine Immunology Cvi, 2012, 19 (4) :508-514.
[12]DONG S, YIN Y, SHEN S, et al.Inhibitory effects of recombinant porcine interferon-alpha on high-and lowvirulence porcine reproductive and respiratory syndrome viruses[J].Research in Veterinary Science, 2012, 93 (2) :1060-1065.
[13]CHINSANGARAM J, MORAES M P, KOSTER M, et al.Novel viral disease control strategy:Adenovirus expressing alpha interferon rapidly protects swine from foot-and-mouth disease[J].Journal of Virology, 2003, 77 (2) :1621-1625.
[14]KIM S M, PARK J H, LEE K N, et al.Enhanced inhibition of foot-and-mouth disease virus by combinations of porcine interferon-alpha and antiviral agents[J].Antiviral Research, 2012, 96 (2) :213-220.
[15]MORAES M P, CHINSANGARAM J, BRUM M C, et al.Immediate protection of swine from foot-and-mouth disease:a combination of adenoviruses expressing interferon alpha and a foot-and-mouth disease virus subunit vaccine[J].Vaccine, 2003, 22 (2) :268-279.
[16]CHINSANGARAM J, KOSTER M, GRUBMAN M J.Inhibition of L-deleted foot-and-mouth disease virus replication by alpha/beta interferon involves double-stranded RNA-dependent protein kinase[J].Journal of Virology, 2001, 75 (2) :5498-5503.
[17]CHENG G, ZHAO X, YAN W, et al.Alpha interferon is apowerful adjuvant for a recombinant protein vaccineagainst foot-and-mouth disease virus in swine, and an effective stimulus of in vivo immune response[J].Vaccine, 2007, 25 (28) :5199-5208.
[18]DU Y, LI Y, HE H, et al.Enhanced immunogenicity of multiple-epitopes of foot-and-mouth disease virus fused with porcine interferon alpha in mice and protective efficacy in guinea pigs and swine[J].Journal of Virological Methods, 2008, 149 (1) :144-152.
[19]DU Y, DAI J, LI Y, et al.Immune responses of recombinant adenovirus co-expressing VP1of foot-and-mouth disease virus and porcine interferon alpha in mice and guinea pigs[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 124 (3) :274-283.
[20]MASON P W, CHINSANGARAM J, MORAES M P, et al.Engineering better vaccines for foot-and-mouth disease[J].Developmental in Biologicals, 2003, 114:79-88.
[21]LEFEVRE F, LA BONNARDIERE C.Molecular cloning and sequencing of a gene encoding biologically active porcine alpha-interferon[J].Journal of Interferon and Cytokine Research, 1986, 6 (4) :349-360.
[22]YERLE M, GELLIN J, ECHARD G, et al.Chromosomal localization of leukocyte interferon gene in the pig (Sus scrofa domestica L) by in situ hybridization[J].Cytogenetics and Cell Genetics, 1986, 42 (3) :129-132.
[23]CHENG G, CHEN W, LI Z, et al.Characterization of the porcine alpha interferon multigene family[J].Genetics, 2006, 382 (11) :28-38.
[24]WEINGARTL H M, DERBYSHIRE J B.The induction and characterization of natural porcine interferons alpha and beta[J].Canadian Journal of Veterinary Researchrevue Canadienne de Recherche Veterinaire, 1990, 54 (3) :349-354.
[25]LEFEVRE F, L′HARIDON R, BORRAS-CUESTA F, et al.Production, purification and biological properties of an Escherichia coli-derived recombinant porcine alpha interferon[J].Journal of General Virology, 1990, 71 (5) :1057-1063.
[26]陈涛, 干瑞嵩, 刘惠莉, 等.重组猪a干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达[J].生物工程学报, 2002, 18 (3) :339-342.
[27]吴丹.猪α干扰素基因的克隆、表达及其抗猪瘟病毒活性的研究[D].北京:中国农业大学, 2003.
[28]曹瑞兵, 张素芳, 蔡梅红, 等.一种新的猪a-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达[J].农业生物技术学报, 2004, 12 (3) :278-282.
[29]曹瑞兵, 徐学清, 周斌, 等.猪a1-干扰素的基因改造与高效原核表达[J].生物工程学报, 2004, 20 (2) :291-294.
[30]谢海燕, 郭霄峰.猪a-干扰素的原核表达[J].华南农业大学学报, 2004, 25 (4) :86-88.
[31]刘占通, 崔保安, 畅舒等.猪a干扰素原核表达载体的构建及表达[J].河南农业大学学报, 2006, 40 (4) :398-401.
[32]刘占通.猪α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究[D].郑州:河南农业大学, 2005.
[33]崔保安, 陈红英, 张素梅, 等.猪a干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测[J].西北农林科技大学学报 (自然科学版) , 2008, 36 (4) :42-46.
[34]李文辉, 刘娣, 王君伟, 等.重组野猪a-干扰素基因的高效表达和下游工艺的研发[J].中国生物工程杂志, 2008, 28 (6) :65-70.
[35]闰若潜, 赵雪丽, 赵明军, 等.猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定[J].中国预防兽医学报, 2008, 30 (7) :570-574.
[36]陈雪梅, 薛清华, 祝荣格, 等.猪Ⅰ型与Ⅱ型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较.生物工程学报, 2009, 25 (6) :806-812.
[37]高明, 魏华.重组猪IFN-a原核表达及其活性分析[J].中国预防兽医学报, 2009, 31 (11) :902-905.
[38]贾自文, 吕茂民, 冯晶晶, 等.猪a-干扰素的原核表达及活性测定[J].生物技术通讯, 2009, 20 (3) :370-372.
[39]夏俊保, 赵俊, 汤仁树, 等.猪a干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定[J].安徽医科大学学报, 2009, 44 (1) :53-56.
[40]宋振威, 周学章, 张仁参, 等.新型内含肽介导PHB系统表达纯化PoIFN-a的研究[J].宁夏大学学报 (自然科学版) , 2010, 31 (3) :264-268.
[41]万博, 鲍登克, 乔松林, 等.猪a干扰素的表达及在PAM细胞系中抗PRRSV活性检测[J].河南农业科学, 2010, 39 (3) :93-95, 99.
[42]杨永胜, 陈春花, 宋勤叶, 等.猪a1干扰素基因的克隆与原核表达[J].中国农学通报, 2010, 26 (11) :1-6.
[43]赵伟鸽, 单同领, 朱建国, 等.猪a、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究[J].上海交通大学学报 (农业科学版) , 2010, 28 (1) :64-69.
[44]闫丽辉, 危艳武, 刘飞, 等.重组猪a干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化[J].黑龙江畜牧兽医科技版, 2011 (1) :99-100.
[45]郑鸣, 边传周, 王老七, 等.猪干扰素α、β和γ的融合表达及活性[J].中国农业科学, 2012, 45 (9) :1840-1847.
[46]黄海.猪a干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达[D].南京:南京师范大学, 2005.
[47]葛丽, 李震, 于瑞嵩, 等.猪a干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达[J].中国兽医学报, 2005, 25 (3) :289-292.
[48]姚清侠, 钱平, 曹毅, 等.猪a-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定[J].中国兽医学报, 2008, 28 (12) :1456-1460.
[49]张存, 叶伟成, 王一成, 等.猪a干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化[J].浙江农业学报, 2010, 22 (1) :6-9.
[50]张蕾, 李鹏飞, 李伟伟, 等.功能性猪a干扰素基因的表达及活性检测[J].安徽农业科学, 2010, 38 (26) :14455-14456.
[51]刘健, 陈瑞爱, 刘珊珊, 等.猪a干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达[J].华南农业大学学报, 2011, 32 (1) :93-97.
[52]王彦彬, 孙向丽, 魏战勇, 等.猪干扰素α和γ在杆状病毒中共表达及对PRRSV抑制作用[J].中国农业科学, 2011, 44 (9) :1931-1938.
[53]CUMMINS J M, MOCK R E, SHIVE B W, et al.Oral treatment of transmissible gastroenteritis with natural human interferon alpha:a field study[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 1995, 45 (3/4) :355-360.
[54]岑路, 贺亮亮, 邓苏理, 等.重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病的研究[J].动物医学进展, 2008, 29 (6) :15-19.
[55]熊忠良, 徐涤平, 李勇, 等.猪基因工程复合干扰素对仔猪病毒性疾病防治效果观察[J].湖北畜牧兽医, 2008 (12) :10-11.
[56]岑路, 岑伟建, 刘键强, 等.猪α-干扰素临床促仔猪生长及疾病预防试验[J].中国畜牧兽医, 2010, 37 (2) :141-143.
[57]崔尚金.猪干扰素基因在腺病毒的表达及应用[J].养猪, 2011 (3) :61-64.
[58]王丹.重组猪!干扰素抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用研究[D].郑州:河南农业大学, 2009.
[59]曹瑞兵, 周国栋, 陈溥言.猪α干扰素对猪圆环病毒2型亚单位疫苗免疫效果的影响[J].畜牧兽医学报, 2009, 40 (6) :867-872.
