第二章 口服益生菌对血液透析病人的便秘症状的改善作用。
2.1 前言。
便秘是由多种病理因素引起的一种临床常见症状，尤其是血液透析患者的便秘程度会加重，排便问题会比较多，比如排便费力、排便频次少或粪便类型不理想，其实便秘本身就容易产生很多疾病，对于便秘症状的就应该早发现早治疗，有便秘症状的患者，其肠道内双歧杆菌、乳酸菌等益生菌数量下降，致病菌数量上升，破坏肠道结构，引发很多排便问题，便秘症状可能会诱发其它心血管疾病的产生，从而危害人体健康，严重干扰着日常活动。在临床中发现此症状要做到及时评估和积极实行干预措施，避免因便秘影响而导致透析相关并发症的相继发生。
本实验益生菌片剂为复合菌片，其中包括副干酪乳杆菌 L9、动物双岐杆菌 A6、嗜酸乳杆菌 A5 和鼠李糖乳杆菌 LGG。其中副干酪乳杆菌 L9 和动物双岐杆菌 A6是中国农业大学乳品实验室自己培养的菌，第一种菌为副干酪乳杆菌 L9（Lactobacillus paracasei L9）是一株从长寿老人粪便中分离得到的益生菌株，前期实验证明该菌株具有较高的安全性[ 48]，是中国农业大学功能乳品实验室分离开发的一株潜在益生菌菌株。研究表明 L9 对小鼠的便秘症状有所缓解[49]，同时也对小鼠的过敏症状起到缓解作用[ 50]，并且可以用来改善人体的肠道环境[51]，同时发酵试验证明菌株具有极强的应用性能[52]。L9 对氨基、糖肽类、糖苷类和喹诺酮类的部分抗生素及氨曲南具有耐受性。第二种菌为动物双歧杆菌 A6，动物双歧杆菌A6 是一株筛选自健康人肠道内的的优良益生菌株而且具有较强的耐受性，还具有多种保健功能如降低胆固醇、增强机体免疫力等。动物双歧杆菌 A6 及其产生的代谢物能够使人体消化酶的分泌速度和肠道的蠕动频率加快，进而促进对食物的消化吸收，改善人体的肠胃功能，可以达到良好的润肠通便作用[53]。第三种菌为嗜酸乳杆菌 A5，其主要存在于小肠中，能够释放乙酸、乳酸和对有害菌起对抗作用的抗菌素来调整人体肠道菌群的平衡，使用这种活菌发酵乳之后可以迅速使肠道内的菌群恢复正常，抑制肠道不良微生物和腐败菌的增殖，是调节肾脏疾病的复合菌株配方中共有的菌株，所以具有良好的营养保健作用。第四种菌为鼠李糖乳杆菌 LGG，是研究最多的菌株之一，也是此杆菌中研究最广泛的代表菌。LGG 是粘附于肠道黏膜和上皮细胞，耐酸性强，在胃肠道中生存，繁殖于肠道，是正常的肠道菌群的组成菌。它有很多作用，包括促进体内有益菌的生长，抑制有害菌的生长，抑制有害酶类或其他有害物质的产生，结合毒素并排出体外[54]，此外还可预防过敏[55]，预防或治疗各种肠道问题[56–57]，加强肠屏障功能，提高免疫能力等[58]。鼠李糖乳杆菌可以预防肠屏障功能障碍和内毒素血症，保护肠道完整性和通透性。LGG 对肠道微生物生态失调和内毒素血症的病理变化有缓解作用，并且改善肠道内环境稳态，调整肠道内 pH 值[59–61] 。
2.2 材料与方法。
2.2.1 益生菌片。
研究使用菌片为公司提供的市售产品，相关实验公司做过，菌片包括副干酪乳杆菌 L9、嗜酸乳杆菌 A5、动物双岐杆菌 A6、鼠李糖乳杆菌 LGG，单片菌片菌数为 300 亿。
2.2.2 主要设备。
2.2.3 实验对象招募与人群实验。
为了便于取样，首先选择 2015 年在北京航天中心医院、北京安贞医院、武警总医院血液净化中心维持血液透析治疗的 150 例被确诊为 ESRD 的患者，均符合年龄介于 18-70 岁之间。从实验对象的筛选条件如下表所示，筛选活动以调查问卷形式进行。
根据表 2-2，共 20 名患者符合筛选条件，每个月进行排便调查、肠道问卷调查和血液指标和粪便的收集，对其进行问卷和血液指标的整理、粪便 pH 的检测和水分含量的检测。益生菌片剂单片菌数至少 300 亿，每日达 600 亿菌可满足不同年龄、性别、体重的实验对象。实验要求每人每天午饭后服用两片益生菌片，持续六个月，选取基线期 V0 期和干预两个月 V2 期和干预六个月 V6 期的数据进行对比。
2.2.3.1 粪便样品的采集及保存。
采样前，研究员预先将采样设备交予受试者。采样设备包括测试纸 2 张、无菌塑料管 3 支、带有 RNAlater 溶液的无菌塑料管 2 支，冰袋 3 个、保温盒 1 个。
受试者将粪便排到测试纸上，光面朝上，不可让尿液或水浸湿粪便，而后迅速用无菌塑料管管盖上连有的小勺采集粪便，并转入无菌塑料管中，旋紧管盖。样品应收集足量，且在分析前勿开管盖。 4 支塑料管用于 pH、水分含量、短链脂肪酸、肠道菌群分析，余下 1 管-80℃冻存备用。
粪便样品分为五管放入有冰袋的保温盒里，五管粪便样品分为 DNA 组、pH检测和水分含量的检测，其余备份。DNA 组放入 4℃冷库保存，pH 组放入-80℃冰箱保存。
基线期期间，受试者需保持正常饮食，但不食用任何发酵乳制品；每日完整填写受试者日志；在 V2 时间点，即第 31 天，采集粪便样品，提交日志。其中，日志内容包括当日饮食种类、 益生菌片摄入情况、药物摄入情况、不适症状（包含腹泻、呕吐、排气、生病感、食欲不振、眼疾和皮疹）、排便次数、粪便形状、便秘相关症状评分。粪便形状以布里斯托尔粪便分类法作为分类标准。
2.2.3.2 粪便分类方法-国际上 ROMEⅢ。
同表 2-2 的 ROMEⅢ要在过去 6 个月中至少有 6 周连续或间断出现（1）满足以下症状 2 个或 2 个以上；（2）在不使用泻药的情况下松散便很少；（3）诊断肠易激综合征依据不充分。受试者需在诊断前 6 个月出现症状，在最近的 3 个月满足诊断标准，同时满足 ROMEⅢ要求符合（1）（2）（3）的即可判断有便秘症状。
2.2.3.3 粪便症状评定方法。
采用布里斯托大便分类法，如表 2-3 所示，根据布里斯托大便分类表对粪便类型进行评分，类型三和类型四为理想状态，类型一和类型二有便秘症状，类型五、类型六和类型七有腹泻症状。排便频率根据受试者日志所述内容计算得到，以“次/周”的形式呈现。粪便形状依据实验对象受试者日志布里斯托尔粪便分类法所述内容得到。
2.2.3.4 粪便 pH 测定。
粪便 pH 的测定是对粪便酸碱度的检查，通过检查能够帮助医生诊断肠道疾病。正常的粪便 pH 值是有三种中性、弱酸性或弱碱性。它的值反应肠道的酸碱性，膳食对粪便酸碱反应有一定影响。所以粪便 pH 的测定也在一定程度上反映日常的饮食习惯和肠道环境。粪便 pH 由 pH 计(德国)检测得到。
2.2.3.5 粪便水分含量测定。
粪便含水量由粪便冻干前后质量差计算所得。计算公式如下：
粪便水分含量=（原粪便重量-冻干粪便重量）/原粪便重量*100%2.3 结果与分析。
2.3.1 实验对象基本情况。
根据实验对象的基本信息，进行整理分析，得出结果如表 2-4 所示：
由表 2-4 可知，20 名实验对象中，女性 8 名，男性 12 名，年龄范围在 48±20。肾病类型为 1.原发性肾小球肾病 6 例；2.糖尿病肾病 9 例；3.高血压肾病 2例；4.多囊肾病 1 例；5.其他 2 例。这 20 名实验对象，性别不同，年龄各异，肾病类型也不同。
2.3.2 便秘及排便问题的结果分析。
基线 V0 期排便费力 11 例、排便不尽感 18 例、块状便和硬便 4 例。排便频次7±7、粪便类型评分-0.56±2.5，其中评分大于-3 小于-1 的有 8 例、大于-1 小于 0的有 5 例、大于 0 小于 3 的有 7 例。
干预 V2 期排便费力 5 例、排便不尽感 6 例、块状便和硬便 1 例、便秘 4 例。
排便频次 8±5、粪便类型评分-1.5±1.5，其中评分大于-3 小于-1 的有 3 例、大于-1 小于 0 的有 17 例、大于 0 小于 3 的有 0 例。
干预 V6 期排便费力 3 例、排便不尽感 3 例、块状便和硬便 2 例、便秘 2 例。
排便频次 8±6、粪便类型评分-1.5±1.5，其中评分大于-3 小于-1 的有 2 例、大于-1 小于 0 的有 17 例、大于 0 小于 3 的有 1 例。
在调查问卷基础上，对实验对象便秘症状整理分析，得出结果如表 2-5 所示：
分析可知，益生菌干预便秘排便费力感、有排便不尽感 ，有显着性差异（P=0.0339、0.0013<0.05），干预 V2 期较基线 V0 期显着减少，干预 V6 期较干预 V0 期显着减少（P=0.0047、0.0001<0.05），干预 V2 期与 V6 期并无显着性差异，并且干预的有持续性。
2.3.3 粪便类型评分结果分析。
在调查问卷基础上，采用 ROMEⅢ标准对粪便类型进行测定，整理分析如表2-6 所示：
表 2-6 表明与干预 V2 期相比基线 V0 期排便频次由一周 3 到 7 次变为一周 5到 9 次，有显着增加（P=0.0156<0.05），干预 V6 期较干预 V2 期有所减少，但较基线 V0 期有所增加。粪便类型评分-1 到 0 分为理想分数，干预 V2 期较基线 V0期和干预 V6 期相比更趋近于-1 到 0 之间，表明干预 V2 期粪便类型有所改善。
2.3.4 粪便 pH 测定结果分析。
对实验对象粪便 pH 值进行测定，整理分析如表 2-7 所示：
2.4 本章小结。
益生菌干预便秘改善从问卷信息上看排便频次、有排便费力感、有排便不尽感 ，有显着性差异，干预 V2 期与 V6 期并无显着性差异，所以干预的有持续性并以干预 V2 期效果最好。说明益生菌对患者的感觉有改善作用，使之感到轻松，心情较干预之前比有所好转，但粪便 pH 和水分含量的变化没有显着性差异。
