引 言
吡咯喹啉醌 ( PQQ) 是 异 于 NAD/NADP 和FMN / FAD 的新型辅酶,能刺激微生物生长、促进神经细胞和生长因子的合成、调节机体自由基水平、保护脑功能、增强对毒性和辐射的耐受性,并且有望成为治疗帕金森病的候选药物。迄今发现能合成 PQQ 的生物主要是革兰氏阴性菌,包括副球菌属( Paracoccus) 、假单胞菌属( Pseudomonas) 、乙酸钙不动杆菌属( Acinetobacte rcalcoaceticus) 、甲烷单胞菌属( Methanomonas) 、甲基芽孢杆菌属( Methyloba-cillus) 、甲基单胞菌属( Methylomonas) 等。但绝大多数菌株发酵产率低,难以实现工业化。肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumoniae) 的 PQQ 合成涉及 6个基因构成的基因簇( pqqABCDEF)。目前 PQQ的合成机制尚未完全阐明,定向改造其代谢途径存在难度。
全局转录工程( gTME) 是用易错 PCR 对 RNA聚合酶的 σ 亚基或其他转录元件进行突变,通过改变 σ 亚基与启动子区域的亲和力,从而影响基因的转录程度。σ 亚基的突变文库能结合大量启动子,可在转录组水平上大范围地影响基因转录,从而导致细胞代谢流量再分配,是一种全新的分子育种策略。据报道 K. pneumoniae 的 σ 因子包括 rpoD、rpoE、rpoH、rpoN、rpoS 等,其中 rpoD 为首要因子。转录过程中,提高 RNA 聚合酶对启动子区域的亲和力,可增强转录的强度。本文基于 gTME 策略,通过易错 PCR 构建 rpoD 基因的突变库,与载体连接后电转化 K. pneumonia DSM2026 构建突变菌株,从大量重组子中筛选 PQQ 高产菌。
1、 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株与载体
肺炎克雷伯氏菌( K. pneumonia DSM 2026) 及表达载体 pET-PK 由本实验室保存和构建,其中PK 代表甘油脱水酶基因 ( GenBank U30903 ) 自身的启动子。肺炎克雷柏氏菌 PQQ 基因簇示意图如图 1。
1. 1. 2 培养基与试剂
LB 液体培养基( g / L) : 蛋白胨 10,酵母提取物5,氯化钠 10,pH 7. 0。LB 固体培养基需加入 1. 5%的琼脂。发酵培养基: 5 × M9 盐溶液 200 mL,1 mol/L MgSO42 mL,20% 葡萄糖 20 mL,1 mol / L CaCl20. 1mL,加灭菌的去离子水至 1000 mL。5 × M9 盐溶液( g/L) : Na2HPO4·7H2O 64,KHPO415,NaCl 2. 5,NH4Cl 5. 0。NBT-Gly 溶液: 20 mmol / L 磷酸盐缓冲液 PBS( 0. 2mol/L Na2HPO4,0. 2mol/L NaH2PO4,pH 7. 0) ,NBT-GlyK+溶液( 预先配制 2 mol/L Gly-KOH 溶液,pH 10) ,使用时加入氯化硝基四氮唑蓝( NBT) ,终浓度为 0. 24 mmol/L。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 扩增目的基因 rpoD
在 NCBI 查得 K. pneumoniae 的 rpoD 基因序列( GenBankACI07699) ,设计引物,以 K. pneumoniae基因组为模板,进行 PCR,扩增 rpoD 基因。上游引物的酶切位点为 EcoR I,下游引物的酶切位点为 SalI,下划线序列为引入的酶切位点。
1. 2. 2 转化重组质粒
将切胶回收的 rpoD 基因和 pET-PK 表达质粒用EcoR I 和 Sal I 于 37 ℃ 下酶解 2 h,用 T4 DNA 连接酶 16 ℃ 连接过夜,构建对照组 rpoD 的重组质粒pET-PK-drpoD。将该重组质粒电转化感受态的 K.pneumonia DSM2026,复苏后涂布于含卡那霉素的LB 固体培养基,37 ℃ 培养过夜。挑取单菌落进行菌落 PCR 和质粒双酶切鉴定。阳性克隆命名为 K. p( pET-PK-drpoD) ,其中 drpoD 意指未进行突变的 rpoD基因。
1. 2. 3 构建突变库
以 rpoD 基因为模板进行易错 PCR,反应体系25μL: Taq DNA 聚合酶缓冲液 2 μL,上下游引物均为0. 5 μL,模板 0. 5 μL,dATP 和 dGTP 0. 2 mmol / L,dCTP 和 dTTP 0. 6 ~ 1 mmol / L,Mg2 +2 ~ 4 mmol / L,rTaq DNA 聚合酶 0. 4 μL。易错 PCR 反应参数为 95℃ 3 min,94 ℃ 1 min,55 ℃ 50 s,72 ℃ 2 min,进行 30个循环; 72 ℃10 min,16 ℃保存。用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。
将切胶回收突变 rpoD 基因和表达质粒 pET-PK用 EcoR I 和 Sal I 于 37 ℃下酶解 2 h,T4 DNA 连接酶连接过夜,构建重组突变质粒 pET-PK-trpoD,得到突变文库,其中 trpoD 意指突变的 rpoD 基因。
1. 2. 4 转化重组突变质粒及筛选阳性克隆
将重组突变质粒 pET-PK-trpoD 电转化感受态的 K. pneumoniae DSM2026,复苏后涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基,37 ℃培养过夜,挑取单菌落进行菌落 PCR 鉴定。
1. 2. 5 重组菌发酵
对照菌 K. p ( pET-PK-drpoD) 及重组菌 K. p( pET-PK-trpoD) 进行24h 摇瓶发酵,设置3 组平行,每隔 3 h 取发酵液,测定吸光度,绘制生物量曲线。
1. 3 分析方法
采用 NBT-Gly 法定性检测 PQQ。300 μL 反应体系包括20μL PQQ 发酵液,80μL PBS,180μL Gly-KOH,20 μL NBT,30 ℃ 避光反应 1 h。吸打混匀后加入到 96 孔酶标板,以去离子水代替发酵液作对照,在波长 530 nm 下测吸光度 A,PQQ 产量与 A 值成正比。提取重组菌 K. p( pET-PK-trpoD) 的质粒进行测序。
2、 结果与讨论
2. 1 对照菌 K. p( pET-PK-drpoD) 的构建
以 K. pneumoniae 基因组为模板 PCR 扩增 rpoD基因,如图 2 所示,在 2000 bp 左右出现条带,与GenBank 公布的 rpoD 基因( 1842 bp) 相符。将重组质粒 pET-PK-drpoD 电转化至感受态 K. pneumoniaeDSM2026,涂布平板培养后挑取单菌落进行培养,提取质粒进行双酶切鉴定,得到质粒 pET-PK ( 约5400bp) 和 rpoD 基因条带 ( 约 1800 bp) ,证明重组质粒pET-PK-drpoD 成功转化到 K. pneumoniae DSM2026中。
2. 2 突变库的构建
以 rpoD 基因为模板,进行易错 PCR 反应。如图 3 所示,泳道 1 ~ 10 所含 dCTP 和 dTTP 浓度相等,其中泳道 1、4、7、10 浓度为 1 mmol/L,泳道 2、5、8 浓度为 0. 8 mmol / L,泳道 3、6、9 浓度为 0. 6 mmol /L。此外泳道 1 ~ 3 Mg2 +浓度为4mmol/L,泳道4 ~6Mg2 +浓度为 3 mmol/L,泳道 7 ~ 10 Mg2 +浓度为 2mmol / L。从产量上看,以泳道 3 的条件为最优。用大体系( 100 μL) ,最佳条件进行易错 PCR 反应,切胶回收 PCR 产物,纯化后的突变 rpoD 基因和 pET-PK 表达质粒用 EcoR I 和 Sal I 于 37 ℃ 下酶解 2 h,T4DNA 连接酶 16 ℃ 连接过夜,构建重组突变质粒pET-PK-trpoD。将重组突变质粒 pET-PK-trpoD 电转化 K. pneumoniae DSM2026,得到突变文库。
2. 3 重组菌阳性克隆的筛选
将突变质粒 pET-PK-trpoD 电转化到感受态的K. pneumoniae DSM2026,涂布培养,挑取单菌落进行菌落 PCR 鉴定( 图 4) ,电泳显示大约 1800 bp 处有条带,证明重组突变质粒 pET-PK-trpoD 已转化至K. pneumoniae DSM2026 中。
2. 4 重组菌发酵生产 PQQ
重组菌 K. p( pET-PK-trpoD) 的生物量曲线如图5 所示。在对数生长期其生长速度和生物量明显快于对照菌 K. p( pET-PK-drpoD) ,发酵3h 后进入平稳期,表明发生突变的 rpoD 影响了相关基因的表达,有利于细胞生长和代谢; 进入平稳期后重组菌生长速度和生长量与对照菌基本持平,推测是对数生长期 PQQ 的过表达消耗了大量葡萄糖,从而无法维持菌体的对数生长。
重组菌 K. p( pET-PK-trpoD) 的 PQQ 产量如图 6所示。从第 3 h 开始重组菌的 PQQ 高于对照菌,且其最高产量达到 76 mg/mL,比对照菌提高了约10% 。这是因为 rpoD 基因的突变扰动了胞内基因的转录,代谢流发生重排,强化了 PQQ 的合成途径。由于辅酶与酶蛋白之间存在严谨的依存关系,微量辅因子即能极大扰动整个细胞代谢,因此 PQQ 远不可能达到乙醇和乳酸那样的产量。
将突变 rpoD 基因测序结果与 GenBank 中的rpoD 基因序列进行 Clustal W2 程序比对,发现 1842个碱基中的突变碱基为 46 个,无碱基缺失现象。翻译出的氨基酸残基中有 3 个发生了突变,分别为D200E、E332G、T569A,突变率为 0. 5% ,如图 7。
用 SOPMA 在线程序( http: ∥www. expasy. ch/tools) 对突变后 rpoD 蛋白质的二级结构进行预测并与突变前相比,发现突变前 α 螺旋、伸展链、β 转角和无规则卷曲的数目分别为 424、31、31、127,突变后的相应数目分别为 418、38、31、126,可见突变的 3个氨基酸残基对 σ 二级结构产生了较大影响,进而影响了 RNA 聚合酶对启动子的亲和力。
3、 结论
用易错 PCR 构建了 K. pneumoniae 的 rpoD 基因突变文库,与载体连接后转化 K. pneumoniae,从约1500 株阳性克隆中筛选了一株 PQQ 生产菌,其产量比对照菌增长了 10%。测序发现其核酸和蛋白水平的突变率分别为 2. 5% 和 0. 5%。二级结构预测发现其 α 螺旋、伸展链、β 转角和无规则卷曲的数目均发生了变化,推测因此影响了 σ 因子与启动子的识别与结合,从而导致转录变化和代谢流量再分配。
