细胞凋亡作为一种增殖细胞最终的转归方式之一参与了多种骨改建过程,如骨缝发育、骨创修复、牵张成骨以及正畸牙槽骨改建等,它在骨骼系统中的研究越来越受到重视。本实验探讨扩张力对大鼠腭中缝组织改建过程中细胞凋亡的影响及细胞凋亡在扩张力作用下大鼠腭中缝组织改建新骨形成过程中的作用。
材料与方法
一、材料
1.动物4周龄健康雄性Wistar大鼠55只(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供),清洁级,体重(78±5)g。由南京中医药大学实验动物中心饲养。
2.主要试剂脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(美国Promega公司)。
二、方法
1.建模与分组55只大鼠随机分为实验组(A组,25只)和对照组(B组,30只)。
A组再分为五个亚组:A1组扩弓1d,A2组扩弓2d,A3组扩弓4d,A4组扩弓4d并固定3d,A5组扩弓4d并固定7d;B组再分为六个亚组:B0组为扩弓前对照,B1组、B2组、B3组、B4组、B5组分别与A组对应,均不扩弓。每组5只。参考Kobayashi等的实验方法建立大鼠上颌扩弓模型。
3%戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司,SCRC69020180,40mg/kg)腹腔注射麻醉下,安装两眼簧腭中缝扩张器,固位臂插于第一、二磨牙邻接点之下,初始力值为50g[即0.49N,由测力计(Dentaurum,Germany)测得]。扩弓2d后,加力一次,约50g。扩弓4d后,用正畸专用树脂(Orthocryl160-112-00,Germany)口内粘固扩弓器的两眼簧,固定期为7d。
2.组织标本的处理过量戊巴比妥钠处死,切取上颌骨腭中缝组织块。取材部位:上颌第一、二磨牙之间的腭板组织,用10%甲醛固定24h,常规进行脱钙、脱水、透明、浸渍、石蜡包埋。沿牵张方向冠状位切片,腭中缝组织石蜡切片制成5μm厚的连续切片,行常规HE染色,光镜下观察腭中缝组织的形态学改变,TUNEL标记法标记凋亡细胞。
三、统计学处理
用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量数据以均数±标准差(珚x±s)表示,组间两两比较采用成组t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、组织学观察
HE染色切片经光学显微镜观察,可见正常的鼠腭中缝由两侧上颌骨腭突板经中央的联合层相接而成。缝组织从内到外依次可见以下结构,即中央丰富的间充质样骨软骨前体细胞层和两侧成熟的肥大软骨细胞层,最外侧为具有骨髓腔的骨板组织。
二、TUNEL检测细胞凋亡
激光共聚焦扫描显微镜下呈黄色荧光的细胞为凋亡细胞,红色荧光为用碘化丙啶(PI)对所有细胞核进行复染的结果。
A1组两侧骨缘处及附近骨小梁之间的凋亡细胞数明显增多,平均每高倍视野下(43±6)个凋亡细胞,A1组细胞凋亡现象多于B1组(P<0.05);A2组凋亡细胞数有所减少,平均每高倍视 野 下 (28±5)个凋亡细胞,仍多于B2组(P<0.05)。A3组凋亡细胞数有上升趋势,平均每高倍视野下(35±5)个凋亡细胞,多于A2组凋亡细胞的数目(P<0.01);A4组凋亡细胞明显减少,与B4组比较无统计学差异,平均每高倍视野下(15±2)个凋亡细胞,伴随着新骨的形成,A5组在骨缝组织边缘及附近骨小梁内可见散在凋亡细胞,与B5组无统计学差异(见封二图1)。而在B组仅见少量凋亡细胞散在分布于骨小梁之间,B组各组之间细胞凋亡数和分布无统计学差异,平均每高倍视野下(12±3)个凋亡细胞。
讨论
细胞凋亡过程中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的黏性3′-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(rTdT)的作用下,可将结合有荧光素或碱性磷酸酶的脱氧核糖核苷酸标记到DNA的3′-OH末端,对凋亡细胞进行检测,这类方法称为TUNEL。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3′-OH形成,很少能够被染色。
TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应凋亡细胞典型的生物化学和形态特征,是一种快速、方便且灵敏度和特异性较高的检测方法。
本实验采用的荧光标记TUNEL试剂盒对脱钙后的骨组织石蜡切片具有较高的特异性和灵敏度。研究结果显示,生长发育期的大鼠腭中缝两侧的骨组织中存在少量的凋亡细胞,呈散在分布。说明细胞凋亡作为一种机体内的固有机制,参与了大鼠腭中缝组织的生长发育过程。两次加力后凋亡细胞数的上升提示扩张力可以诱导凋亡细胞数量的改变,应力介导的细胞凋亡参与了扩张力作用下的腭中缝组织改建过程。
骨细胞是分布在钙化骨基质中的静止成骨细胞,在骨组织更新中的作用尚存争议。Gu等认为局部的骨细胞凋亡在诱发局部的骨改建过程中起着主要作用。Clark等研究结果显示,骨细胞的凋亡可能在骨愈合信号传导过程中,在诱导破骨细胞的分化和增殖过程中起着重要的作用。
Li等研究发现牵张成骨过程中,凋亡细胞主要出现在纤维组织和矿化前组织之间的过渡区,以及生长中心附近的新骨表面或周围,细胞凋亡与牵张成骨的新骨形成和骨组织改建过程密切相关。腭中缝组织的扩张属于典型的缝牵张成骨过程。本研究发现扩张力作用于腭中缝组织之后,细胞凋亡的变化主要出现在骨缝边缘及附近的骨小梁内,两次加力后凋亡细胞数均有上升,提示牵张力可以诱导骨细胞的凋亡,而在固定期,伴随着新骨的形成和腭中缝组织的恢复,骨缝边缘及附近骨小梁内骨细胞的凋亡数目恢复正常,与对照组比较差异无统计学意义,提示应力介导的骨细胞的凋亡在骨改建的诱发过程中可能起着某种信号传导的作用,对缝组织牵张后的骨改建有着重要的生物学意义。分析其机制可能:骨缝边缘及附近骨小梁内的骨细胞受到牵张力的作用后发生了凋亡,凋亡的骨细胞可以促进附近的软骨细胞继续分泌软骨基质,同时加速中央间充质样细胞的分化、增殖和成熟,继而形成类骨质,而在固定期,凋亡的骨细胞已通过一定的途径被机体清除,故而实验组与对照组差异无统计学意义。
虽然本实验所使用的荧光TUNEL标记法对于石蜡切片中凋亡细胞的检测具有较高的特异性和灵敏度,但是由于其无法精确的显示凋亡细胞的形态,故要想明确凋亡细胞的种类,还需要进一步的验证。而且腭中缝受到机械刺激所产生的适应性改建机制比较复杂,细胞凋亡的传导途径和影响因素也比较多,要想了解其具体的调控机制和信号传导通路,还有待于进一步的研究。
