内皮祖细胞（ endothelial progenitor cells,EPCs）是一群具有游走特性，能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞； 缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，是血管内皮细胞的前体细胞； 具有增殖、迁移、分化成内皮细胞和聚集形成新生血管的作用，主要参与出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复。Wnt3a 是wnt 家族的重要成员之一，其对细胞的增殖与分化等过程有重要的调控作用。本实验以大鼠 wnt3a 基因为靶点，构建沉默型 pEGFP-shRNA-wnt3a 重组质粒载体，并用脂质体介导转染大鼠骨髓源性 EPCs,观察 wnt3a 蛋白表达水平的改变及对细胞增殖的影响，为进一步研究 wnt3a 及其下游靶基因调节 EPCs的功能研究提供实验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物 SD 大鼠 15 只，90 ~ 120 g,SPF级，雄性，由安徽医科大学实验动物中心提供。
1. 1. 2 主要试剂 EGM-2 完全培养基购自瑞士Lonza 公司； 淋巴细胞分离液购自天津 TBD 公司； 大鼠纤维联接蛋白（ rat fibronectin,FN） 购自瑞士 GeneOperation 公司； CD133 抗体购自美国 Biorbyt 公司；Dil 标记的乙酰低密度脂蛋白（ Dil-ac-LDL） 购自美国 Invitrogen 公司； 异硫氰酸荧光素荆豆凝集素-1（ FITC-UEA-1） 购自美国 Sigma 公司； 重组质粒（pEGFP-shRNA-wnt3a） 购自合肥昊翔生物科技有限公司； 脂质体 Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen公司； wnt3a 一抗购自美国 Cell Signaling 公司； 二抗购于上海碧云天生物技术有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 EPCs 的采集、分离和培养 取 90 ~ 120 g大鼠颈椎脱臼法处死，无菌操作台中取股骨及胫骨骨髓血，采用密度梯度离心法分离纯化单核细胞； 用含 10%FBS 的 EGM-2 完全培养基，吹打分散细胞，计数细胞并以 1 ×107/ ml 的密度接种预包被 FN 的培养瓶； 置于 37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养 4 d,弃去未贴壁细胞； 以后每隔 2 d 后换液 1次，每天观察并记录细胞生长形态变化。约 8 ~ 10d 后，细胞铺满瓶底即可传代。
1. 2. 2 EPCs 的鉴定
1. 2. 2. 1 EPCs 免疫细胞化学 CD133 及 VEGFR-2双抗体荧光检测 取生长良好的原代 EPCs,用胰酶消化并接种于装有盖玻片的 24 孔培养板中，置于37 ℃ 、5% CO2的恒温细胞培养箱中； 次日显微镜下可见 EPCs 生长良好，PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min; 加入 4%多聚甲醛固定 20 min,0. 3% Triton X-100 破膜 10 min,10% 山羊血清封闭 1 h,吸弃多余血清；滴加小鼠抗 CD133（ 1 ∶ 100） 及兔抗 KDR （ 1 ∶ 100）一抗，4 ℃ 过夜。次日 PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min.
加入二抗 （ 1 ∶ 500） ,37 ℃ 避光孵育 1 h; 加入终浓度为 10 μg/ml Hoechst33342 核染 5 min,吸弃多余染料，PBS 漂洗后加入抗荧光淬灭液封片，荧光显微镜观察结果。
1. 2. 2. 2 EPCs 的 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-1 荧光检测 取生长良好的原代 EPCs,用胰酶消化并接种于装有盖玻片的 24 孔培养板中，置于 37 ℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中； 次日显微镜下可见 EPCs生长良好，PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min.每孔加入 10μg/ml 的 DiI-ac-LDL 500 μl,37 ℃ 避光孵育 4 h;PBS 漂洗后加入 4% 多聚甲醛于 4 ℃ 避光固定 10min,PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min.每孔加入 10 μg / ml的 FITC-UEA-1 500 μl,37 ℃ 避光孵育 1 h; 吸弃多余染料，PBS 漂洗后加入抗荧光淬灭液封闭，荧光显微镜观察结果。
