不能产生动作电位的非可兴奋细胞（ 血液细胞、上皮细胞、结缔组织、骨骼、肿瘤细胞等） 接受宽频电场作用后，细胞可产生极化的被动响应，即频域细胞被动电特性（passive electrical propertiesof cells）。细胞电阻抗、膜电容、电导率、电阻率、介电常数等均为频域细胞电生理学参数。
利用快响应、低成本、高敏感的电阻抗技术，检测细胞阻抗谱可对癌细胞进行鉴别，并已应用于乳腺癌细胞的鉴别[1],膀胱癌的诊断分析[2],白血病K562癌细胞的鉴别[3]等。电阻抗技术作为一种非侵入式和无标记的技术，在黄斑变性定量分析[4]、G蛋白偶联受体的研究[5]和细胞周期检测[6]等方面也得到了应用。
NCM460细胞是人正常结肠细胞，通常作为结肠癌的对照组细胞。因其易于培养，转染效率高的特 点，以 往 主 要 集 中 在 细 胞 的 增 殖 与 凋亡[7],浸润与转移[8]等方面的研究，缺少电学特性的研究报道。本文采用细胞体外培养和交流电阻抗技术，测量NCM460细胞电阻抗谱，建立正常细胞的电生理指标，目的是为进一步研究结直肠癌细胞（COLO 205,SW48,Lo Vo等） 的电生理变化奠定基础。
2 方法
2. 1细胞培养
NCM460细胞购自INCELL公司，使用RPMI-1640（GIBCO公司） 培养基进行培养。培养基含10%小牛血清 （Hyclone公司） ,1% 100 U / m L青霉素和链霉素（GIBCO公司）。细胞培养环境设置为温度37 ℃，5% CO2,湿度100% .细胞经过培养传代后，无菌条件下经胰酶消化收集至15m L离心管中，25 ℃，1000 r / min离心10 min,得到高浓度富集细胞悬液。
2. 2测量池
由透明有机玻璃圆管两侧嵌入两平行铂片制成，电极圆盘直径d = 3. 2 mm,电极间距L = 9. 4mm,容积约73. 29 μL.测量在（25 ± 1）℃进行。
2. 3阻抗测量
电阻抗谱测量由计算机控制的精密阻抗分析仪（Agilent 4294A） 完成。在40 Hz ~ 110 MHz频率范围内选取201个点，每个频率点设定自动循环扫描测量3次。每个细胞样本的测量在1 min之内完成。交流激励信号源电压100 m V,测量幅值| Z|和相位角θ，复数阻抗Z*= | Z | e- jθ= Re Z -j Im Z,复阻抗实部Re Z = | Z | cosθ，复阻抗虚部Im Z= | Z | sinθ，这里j槡= √- 1,ω = 2πf,f为激励信号频率。测量过程中对细胞悬浮液施加的电压100m V,不会对细胞状态造成影响。
2. 4细胞容积比值
采用毛细比容管离心方法，把细胞悬浮液注入其中，用Haematokrit 210微量血液离心机以9000 r / min离心10 min,细胞容积比值=（l / L）× 100%,其中l为细胞的长度，L为细胞与上清液的总长度。
3 结果与讨论
3. 1细胞容积比值对幅频曲线和相频曲线的影响
图1显示NCM460细胞电阻抗幅值（| Z |）、频率（f） 和细胞容积比值（CVR） 的三维立体图。在| Z|与f的平面，构成了幅频曲线： 随频率增加，阻抗幅值由低频阻抗幅值（ZL） 逐渐减小至高频阻抗幅值（Zh） ,表现出较大的弛豫过程，此过程与其他细胞相似，如血液[9-10]、肝癌细胞[11]和肺鳞癌细胞[12].其原因是在较低频率电场作用细胞时，诱导出细胞极化，即细胞膜电容呈开路，阻抗较大，电流在低阻抗的细胞外区域流动； 随电场频率的增加，细胞的极化状况逐步减小； 当较高频率电场作用细胞时，细胞极化状况极低，细胞膜呈现短路，阻抗（ZC= 1 / jωC） 较小，电流极易流过细胞内，故表现出低频高阻抗，高频低阻抗的弛豫过程[11].
细胞属于非均匀电介质，电场致细胞极化，产生电位移，相位角θ就是电位移与电场强度之间存在位相差。低频交流电场作用于细胞悬浮液时，电流选择电阻抗较小的细胞外液区域流动，绕过细胞，表现为相位角接近于零的细胞电特性； 当交流电场作用细胞膜时，相位角出现峰值θp,它反映了细胞膜电容性弛豫性的变化过程，表明细胞膜对 交 流 电 场 的 响 应 特 性，称 为 特 征 频 率（characteristic frequency,fc）。
图2所示NCM460细胞的相位角（θ）、频率（f） 和细胞容积比值（CVR） 的三维立体图。在θ与f的平面，构成了相-频曲线，随频率增加，相位角表现出不同特征： 在f = 102~ 104Hz范围，θ值接近零； 在f = 104~ 107Hz范围，θ值出现明显的山峰型弛豫，其峰值频率是中心特征频率fc,峰顶 点到横坐标的落差是相位角峰值θp（ 图2左上图） ; 在f = 107~ 108Hz范围，θ值上扬。
3. 2细胞容积比值对复阻抗平面图的影响
图3表示不同比容NCM460细胞的Nyquist图，又称复电阻抗平面图。此图呈现由低频到中频的半圆弧轨 迹 和 高 频 的 翘 尾 现 象。复 阻 抗（Z*） 由实部（Re Z） 和虚部（Im Z） 组成： 实部系电阻，虚部系电容阻抗。在10 k Hz ~ 7 MHz范围，细胞膜极化效应引起电容性变化的β散射，即Max-well-Wagner效应[13],在图3表现成半圆弧特征；当电场频率f = 7 MHz ~ 100 MHz时，细胞膜短路，电感成分引出图3的翘尾现象。右截距是低频阻抗实部（Re ZL） ,圆弧顶点到横轴距离是阻抗虚部峰值（Im Zp） ,圆弧峰值对应的频率称为中心特征频率fc,fc与细胞容积比值呈线性关系，其线性方程为：fc= 0. 71 - 0. 0024CVR.其一元线性回归方程的斜率K = - 0. 0024极低，即回归直线近乎与横坐标轴平行，这说明特征频率与细胞容积比值的变化无关（ 图3）。
NCM460细胞的fc=（0. 64 ± 0. 04）MHz,与乳腺癌细胞（MCF-10A的fc= 0. 16 MHz,MCF-7的fc= 0. 31 MHz,MDA-MB-231的fc= 0. 26MHz） 比较发现属于同一数量级，但高于乳腺癌细胞[1],说明特征频率fc可以作为鉴别不同种类细胞的指标。Nyquist图是细胞阻抗实部与虚部的关系。随着细胞容积比值的增加，圆弧曲线整体右移、扩展，其半径和面积增大，Re ZL和Im Zp皆增加。其主要原因在于，当细胞数量增加，细胞膜的面积增大，膜极化强度加大，在实部表现细胞阻抗增加，在虚部反映细胞能量损失增大。故通过宏观的复阻抗平面图可以反映微观的细胞膜极化变化和细胞能量损失状况。
图1 ~图3采用的NCM460细胞电阻抗频谱特征参数见表1.
3. 3细胞容积比值对NCM460细胞特征参数的影响
图4显示了NCM460细胞的阻抗特征参数（ΔZmax,θp,Re ZL,Im Zp） 与细胞容积比值之间的散点图，并且这些指标与CVR均呈线性关系。在不 考虑负号的情况下，这4个指标（ΔZmax,θp,Re ZL,Im Zp） 随CVR增加而增大。其线性回归方程分别为：ΔZmax= - 16. 36 + 1. 69CVR;θp= 1. 22- 0. 26CVR;Re ZL= 34. 59 + 21. 2CVR;Im Zp=7. 71 - 0. 6CVR.
细胞膜是由含有蛋白质的磷脂双分子层构成，具有很低的离子通透性，可视为绝缘的壳。低频下，细胞膜对电场中电流具有阻碍作用，细胞量的增多，细胞膜的极化强度和密度随之增加，相当于增大了体系中的电阻，因此，Re ZL、ΔZmax（ΔZmax= ZL- Zh） 皆增加。据此特点无标记细胞增殖检测技术得到了应用[14].如前文所述，细胞膜极化是产生β散射的原因，θ是由于极化强度跟不上电场变化而产生的相位差，θp的产生是由于在一定频率下，细胞极化强度与电场强度达到了瞬间的饱和值（ 图2） ,它同Im Zp一样可被视为电场中的“损失”部分。细胞量的增多显然会使这种“损失”增大。
4 结论
通过细胞阻抗谱的分析可以得到NCM460细胞的电阻抗特性： 阻抗幅值和相位角是电场频率的函数； 阻抗特征参数（ΔZmax、θp、Re ZL、Im Zp） 随细胞数量（ 细胞容积比值） 的增加而增加； 特征频率（fc） 可 作 为 鉴 别 细 胞 的 频 域 电 生 理 指 标。NCM460细胞通常作为结肠癌的对照组细胞，表征NCM460细胞的电学特性可为进一步探讨结肠癌细胞电生理变化提供帮助。
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