超声波是一种高频声波，也是机械能的一种形式，通过高频 ( 1 ～12 MHz) 的压力波来传递能量，低强度脉冲超声波 ( LIPUS) 一般指强度 ＜ 100 mW/cm2的超声波。20 世纪 80 年代初 Duarte 首先报道了 LIPUS ( 强度为 30 mW/cm2) 能加速动物骨折愈合，他们的研究进一步发现: 低强度脉冲超声波可刺激骨折愈合，缩短愈合时间。根据 Wolf 定律 “骨的形成与结构可随外力的大小与方向而重建，骨骼的生理反应和愈合过程可受机械力学影响”，超声产生的机械力刺激是否也能对骨骼的愈合产生影响逐渐受到人们的关注。干细胞的分化方向不仅取决于其自身与外界调控信号之间的相互作用，而且还受到周围组织的三维结构及机械力的影响。而脂肪干细胞( adipose derived stem cells，ADSCs) 以其来源丰富、较易获取、一次取材即可获取大量细胞及对机体创伤较小等优点，成为继 BMSC 以外另一个研究热点。本实验旨在研究低强度脉冲超声波对脂肪干细胞成骨分化效能的影响。
1 材料、仪器和试剂
1. 1 标本采集脂肪细胞取自于无锡市人民医院 18 ～ 45 岁手术患者，部位为腹部及腰背部处，不合并重大内科疾病，经知情同意。取下的脂肪细胞经分离培养后用于本实验。
1. 2 实验试剂和材料DMEM － 低糖培养基 ( 美国 Hyclone 公司) ，Gibco胎牛血清 ( 美国 Invitrogen 公司) I 型胶原酶、胰蛋白酶、BSA ( 美国 Sigma 公司) ，青链霉素 ( 美国 GIBeo公司) ，地塞米松 ( 美国 Sigma 公司) ，维生素 C ( 美国 Sigma 公司) ，油红 O ( 美国 Sigma 公司) ，吲哚美辛 ( 美国 Sigma 公司) ，IBMX ( 美国 Sigma 公司) ，EDTA ( 美国 Sigma 公司) ，CD29 /CD14 /CD44 /CD45 /CD105 抗人单克隆抗体，抗鼠 IG1、IG2，EDTA ( 美国 Sigma 公司) 碱性磷酸酶检测试剂盒 ( 南京建成) ，培养板及培养瓶 ( Corning 公司) ，Exogen2000 超声波骨折治疗仪 ( 北京诺亚) ，医用超声耦合剂 ( 上海洪康) 。
1. 3 脂肪间充质干细胞 ( ADSCs) 的分离培养脂肪组织剪成 1 mm ×1 mm ×1 mm 左右小块。转移至 5 ml 的离心管中，加入 5 倍体积的 0. 1% Ⅰ型胶原酶溶液，密封离心管。将离心管放入 37℃的恒温振荡箱中，振荡消化 45 ～60 min，等体积 DMEM － 低糖培养基中和，1 500 r/min 离心 10 min。弃上清，用PBS 溶液离心漂洗沉淀两次。加入培养基重悬沉淀，200 目不锈钢筛网过滤，1 500 r /min 离心 5 min。培养基重悬后，制成细胞悬液，然后细胞计数，按 2 ×105的密度接种于 35 cm ×35 cm 的培养瓶内，置于 37℃、5% CO2的饱和湿度恒温培养箱中培养。于 12 h 后首次半量换液，之后每 3 d 更换 1 次培养液。当细胞达到 90%融合时用约 1 ml，0. 02% EDTA + 0. 25% 胰蛋白酶的混合消化液 ( 1∶1 体积比) 37℃消化 1 ～2 min，待细胞回缩成圆形时加入培养基中和，并以 1∶2 或1∶3传代培养。
1. 4 ADSCs 的表面抗体检测取第 6 代生长接近融合的细胞，以 0. 02% EDTA+ 0. 25% 胰蛋白酶的混合消化液消化，加入适量 PBS，以 1 300 r/min 离心 5 min，弃上清，收集细胞。以Buffer 溶液重悬细胞，调整细胞密度为 3. 0 × 106/ml。
根据需要，准备好样品管 ( 2 ml Ep 管) 并于管上标记好抗体信息。于每个样品管内各加入 100 μl 细胞悬液。按 照 试 剂 推 荐 剂 量 分 别 加 入 CD29、CD44、CD45、CD14、CD105，鼠 IG1 和 IG2 作为对照。
1. 5 ADSCs 向成骨诱导及鉴定取所得第 4 代脂肪干细胞，传代消化后，接种于4 块六孔板中，待细胞生长至 90% 融合时开始本实验，分为四组，( 1) 阴性对照组: ADSCs 于完全培养基中培养，不接受 LIPUS 刺激; ( 2) LIPUS 组: AD-SCs 于完全培养基中培养，接受 LIPUS 刺激; ( 3) 成骨诱导组: ADSCs 于成骨诱导培养基中培养; ( 4)LIPUS 联合成骨诱导组: ADSCs 在成骨诱导培养基中培养，接受 LIPUS 刺激。设置 LIPUS 参数为: 频率1. 5 MHz 的正弦超声波，脉冲频率 1. 0 kHz，脉冲时间200 ms，间隙时间为 800 ms，空间时间平均强度为100 mW /cm2。实际 LIPUS 刺激和虚设 LIPUS 刺激均是 1 次/d，在相同的时间点进行，每次 20 min。虚设的 LIPUS 刺激时超声波发生器不打开。在进行细胞周期检测和成骨分化实验时，ADSCs 均使用 6 孔板培养，实验所使用的超声波探头直径为 5 cm，大于培养皿底部，可在培养皿底部的耦合剂上，探头平面向上，培养皿水平放置。刺激在室温下进行。刺激后放回培养箱。茜素红染色: 培养 2 周后，向各六孔板中加入 40 mg/cm3多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗 3 次，加入 0. 2%茜素红溶液，37℃ 染色 30 min，蒸馏水洗去多余染料，晾干后，甘油明胶封固，镜检。碱性磷酸酶 ( ALP) 活性测定: 各组细胞培养 7、14 d 后，弃去培养液，终止培养，采用 PBS 洗 3 次，随后加入pH 7. 4 的十二烷基硫酸钠溶解细胞，以 1 000 r /min离心 10 min，取上清液采用试剂盒行碱性磷酸酶活性测定。
2 结果
2. 1 ADSCs 形态观察原代培养 12 h 后可见贴壁细胞，初始阶段为小圆形，48 h 后可见短梭形、梭形及多角形 ( 图 1a) ，细胞突起相互连接，8 ～9 d 后单层细胞融合接近 90%。传代细胞 6 h 即可观察到贴壁、细胞生长迅速，多数为类成纤维细胞，圆形细胞逐渐减少，7 d 后细胞即可单融合。分选的第 3 代细胞开始形态均呈梭形，接近融合状态，按 1∶2 或 1∶3 传代培养，3 d 可长至融合状态 ( 图 1b) ，细胞传至第 10 代时，发现细胞形态特征无明显变化。【图1.略】
2. 2 细胞表面标志物分析通过流式细胞仪分析第6 代 hADSCs 细胞表面特异性标记结果显示: CD105: 99. 61%，CD29: 97. 54%，CD45: 0. 26% ，CD44: 97. 4% ，CD14: 2. 51% ( 图 1c ～g) 。
2. 3 茜素红染色茜素红染色结果显示 LIPUS + 成骨诱导组茜素红染色颜色最深，其次为单纯诱导组，LIPUS 组几乎染色无变化 ( 图 2a) 。【图2.略】
2. 4 ALP 活性测定结果成骨培养基诱导组碱性磷酸酶活性在第 7 d 和第14 d 比对照组分别增长了 93. 3% 和 238. 1% ( P ＜0. 05) 。成骨培养基诱导联合低强度脉冲超声组的碱性磷酸酶活性在第 7 d 和第 14 d 比对照组分别增长了191. 8% 和 444. 2% ( P ＜ 0. 05) 在第 7 d，成骨培养基诱导组和成骨培养基诱导联合低强度脉冲超声组的碱性磷酸酶活性无明显差异，而在第 14 d，成骨培养基诱导联合低强度脉冲超声组的碱性磷酸酶活性明显高于成骨培养基诱导组 ( P ＜0. 05) 。
3 讨论
超声波的生物效应机制主要为温热效应、机械效应和理化效应。最早应用于治疗的超声波频率为 1 ～3MHz，剂量一般为 1 ～ 210 W /cm2，且多为连续波。
LIPUS 的声强一般不超过 30 mW /cm2，脉冲时间在200 μs 以内，重复频率在 1 MHz 左右，作用时间不超过 20 min/d，其传递给组织的机械能量一般 ＜ 3 mg/cm2。LIPUS 使用时不会在接触组织局部产生热量，避免了热损伤等不良反应，并能刺激细胞增殖及细胞外基质合成。研究发现，LIPUS 对骨折愈合具有明显促进作用，特别是对于骨延迟愈合和不愈合具有较高的治愈率。Duarte 等通过大样本的临床前瞻性研究发现: LIPUS 对骨折 14 个月以上骨不连病例的治愈率达85% ，对延迟愈合病例治愈率达到了 91% 。但关于其促进骨折愈合的机制尚不甚明确，且目前研究大多集中在 LIPUS 作用于骨折局部的宏观水平，对其在细胞水平的作用研究较少。骨折愈合是一个复杂而有序的病理过程，涉及一系列细胞的募集、增殖及分化。脂肪干细胞 ( adipose derived stem cells，ADSCs) 为近年来新近发现的一种成体干细胞，作为一种来源于中胚层的成体干细胞具有多向分化的潜能，在向成骨细胞诱导的条件培养基中可向成骨细胞分化，是优秀的自体组织工程的种子细胞之一。
本实验检测到 LIPUS 刺激 ADSCs 后碱性磷酸酶( ALP) 活性的增强和矿化结节的形成。ALP 是成骨细胞分化的一个早期的标志，ALP 在骨化中起重要作用，在矿化开始之前其活性达到峰值，随着矿化的进展，ALP 活性又会逐渐平稳甚至下调。本实验发现，LIPUS 处理的 ADSCs 比对照组在 7 d 和 14 d 时表现出更高的 ALP 活性，这一结果接近先前的一个研究。
成骨细胞体外培养具有产生特异性钙结节的能力，以提供骨组织形成的基础条件，这是成骨细胞的另一重要特征。本实验中也检测到 LIPUS 刺激 ADSCs 后出现钙染色结节。从上述的实验结果中，作者推断，LIPUS 作用可以增加钙沉积从而导致 ADSCs 产生矿化结节。
总之，本实验观察到单因素强度为 100 mW/cm2的 LIPUS 促进 ADSCs 的成骨分化作用，联合应用 LI-PUS 和成骨诱导培养基有望成为一种新的促进人脂肪干细胞成骨的方法，在组织工程中具有重大的应用潜能，其分子机制有待于在未来的研究中作进一步的探讨。
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