诱导多潜能干细胞 （induced pluripotent stemcells,i PSCs） 是通过在分化的体细胞中表达特定转录因子，以诱导体细胞重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。i PSCs在功能上类似于胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs） ,增殖分化能力强，既能避免免疫排斥，又不涉及伦理道德问题，而且取材方便，具有重要潜在临床应用价值[1].因此，自开始培养出i PSCs[2,3]以来，全世界众多实验室都对i PSCs进行了研究并取得了很大进展。
但将i PSCs用于脑内移植治疗卒中动物模型后发现，i PSCs极易形成肿瘤，也难以确定有无成熟神经元形成[4 ~ 6],对模型动物行为学改善也报道不一[4 ~ 6]; 即使将i PSCs植入正常小鼠脑内也一样具有成瘤性[7].
由于i PSCs在形态及生物学功能上类似ESCs而会在移植后形成畸胎瘤[8],故许多人认为如果移植前将ESCs在体外预先分化就可以减少肿瘤形成的危险性[9].这可以先将ESCs诱导成神经前体细胞（neural precursor cells,NPCs） ,再把ESCs来源的NPCs植入脑内。研究发现，这种NPCs不但可以存活，而且能向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，甚至有的细胞具备成熟神经元的电学特性，重要的是没有出现肿瘤[10 ~ 12].目前报道的将ESCs诱导成NPCs的方法有多种，但一般都难以重复。为此，本实验采用经拟胚体（embryoid bodies,EBs）以及N2B27为选择培养基，多步法贴壁培养诱导NPCs,为国内从事本领域研究的同道提供借鉴，也为下一步细胞移植治疗缺血性脑损伤做准备。
材料和方法
1.小鼠i PSCs的培养
本实验i PSCs由中国科学院动物研究所提供，培养方法参照文献[13].
2. i PSCs向NPCs的诱导
吸去ESCs培养液，PBS洗3次后用0. 05%的胰蛋白酶消化2min,ESCs培养液中和，玻璃吸管吹打，1000r/min离 心5min,去 上 清。添 加 新 鲜 的ESCs培养液，玻璃吸管吹打成单细胞悬液，接种到0. 1%明胶包被 的瓶 内，37℃ 、5% CO2孵 育30 ~60min,去 除 胎 鼠 成 纤 维 细 胞 （mouse embryofibroblast,MEF）。吸取细胞悬液，1000r / min离心5min,吸去上清，添加N2B27培养基重悬细胞，接种在无任何包被的瓶内，入37℃、5% CO2孵箱培养，次日观察EBs的形成。EBs培养4 ~ 7d,每天换液。离心收集EBs,用N2B27培养基将其重悬，接种在0. 5%明胶包被的塑料培养瓶内贴壁培养，隔天换液。10d后EBs爬出神经干细胞样细胞，0. 05%胰蛋白酶消化，接种在0. 1%明胶包被的6孔板上，用NPCs培养基培养，每天换液，2 ~ 3d传代。
N2B27培养基200ml包括DMEM / F-12 99ml,N-2Supplement 1ml,2%牛血清清蛋白（BSA）250μl,Neurobasal 98ml,B-27Supplement 2ml,10g / L胰岛素200μl,200mmol / L谷氨酰胺2ml,10mmol / L β-巯基乙醇2ml,105IU / L青链霉素200μl.
3. NPCs的培养
待细胞长满接近95%左右汇合时，吸去培养液，0. 05%胰蛋白酶消化2min,立即用MEF培养基终止消化，吹打，离心。去上清，用NPCs培养基重悬细 胞，接 种 在0. 1%的 明 胶 预 先 包 被 （37℃，30min） 的孔板（ 或培养瓶） 内，37℃ 、5% CO2孵箱培养。或去上清后，加适量的NPCs冻存液，放入梯度冻存盒- 80℃过夜，次日入液氮。
NPCs培养基200ml是在200ml N2B27培养基的基础上添加0. 1g /L的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）40μl和0. 1g /L表皮生长因子（EGF）40μl.
4. NPCs的分化
将NPCs在原有NPCs培养基的基础上去掉Neurobasal、B-27Supplement,进行培养传代，7d后光学显微镜下观察细胞形态的改变，进行免疫荧光染色。
5. NPCs的鉴定
采用免疫荧光染色进行鉴定。将NPCs与在分化培养基内培养的NPCs分别传代到0. 01%多聚赖氨酸包被的放有小圆片的24孔板内，过夜，细胞贴壁。次日，弃去培养基，PBS快速洗1次。4%的多聚甲醛固定30min,PBS洗3次，每次5min.0. 3%PBST打孔，室温孵育30min.10%正常山羊血清封闭1h（ 用0. 3% PBST稀释）。一抗小鼠抗巢蛋白（Nestin,1∶ 1000,Abcam公司） 抗体、兔抗β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ，β-Tub-Ⅲ，1∶ 800,Sigma公司） 抗体孵育，4℃冰箱过夜（ 用封闭液稀释一抗） ,PBS洗3次，每次5min.二抗（Alexa Fluor 594山羊抗小鼠Ig G,Alexa Fluor 488山羊抗兔Ig G,用封闭液1∶ 500稀释，Invitrogen公司） 室温避光孵育1h,PBS洗3次，每次5min.Horchest33258（1 ∶ 3000 PBS稀释，Sigma公司） 复染细胞核10min,PBS洗3次，每次5min.70%的甘油封片，荧光显微镜下观察。对照组用PBS代替一抗。
结 果
1. i PSCs的培养
i PSCs在饲养层细胞上克隆性成团生长。每个i PSCs克隆大小基本一致，呈近似圆形、椭圆形或梨形均匀分布在交错呈网的MEF上，整个克隆形态饱满，透光性好（ 图1）。
