细胞培养论文（专业范文8篇）

　　细胞培养技术是分子生物学研究中的重要手段,该技术作为近年来的研究热点，现已广泛应用于生物学、医学等多个领域，并且作为新型的药物不断进入临床研究领域，成为某些重大难治性疾病治疗的新亮点。本文总结了8篇专业“细胞培养论文范文”，以供参考。

　　细胞培养论文（专业范文8篇）之第一篇：基于细胞培养的流感疫苗研究进展

　　摘要：接种流感疫苗是预防流感最有效的手段。当前广泛使用的依赖于鸡胚的流感疫苗生产技术难以有效应对不断提高的流感防控需求。使用动物细胞基质代替鸡胚培养进行流感疫苗生产成为流感疫苗技术创新的重要趋势。近年来,基于不同细胞基质的季节性流感疫苗和大流行流感疫苗在多个国家和地区获批上市,为流感流行和大流行有效防控提供了重要支撑。本文分别从细胞基质、疫苗工艺与质量控制以及疫苗临床安全性和免疫原性评价等方面阐述了基于细胞培养的流感疫苗研究进展,并对细胞基质流感疫苗的应用现状和未来发展进行分析探讨。

　　关键词：细胞培养,细胞,流感疫苗,质量控制,免疫原性

　　流感是由流行性感冒病毒(简称“流感病毒”)引起的一种发病急、传染性强、传播速度快的呼吸道传染病。据WHO统计，每年流感的季节性流行在全球可导致300万～500万例重症病例、29万～65万例死亡病例[1]。时而发生的流感大流行(如2009年甲型H1N1流感大流行)和人感染H5N1,H9N2,H7N9,H5N6等禽流感疫情也给人类健康带来巨大危害和潜在威胁[2]。接种疫苗是预防流感最有效的手段。70多年来，基于传统鸡胚培养的流感疫苗在流感防控中发挥了积极作用，但存在潜在的不足，如疫苗生产依赖于大量符合质量标准的鸡胚有计划供应，疫苗生产工艺劳动强度较大、难以全面实现自动化，疫苗病毒株较易发生传代适应性变异，鸡胚潜在致病因子污染与残体无害化处理等问题;特别是在高致病性禽流感流行期间，可能会因鸡胚供应问题导致疫苗制备原料缺乏，疫苗供应存在极大隐患。以上潜在不足也是限制流感疫苗产能扩大、质量提升和应急生产能力提高的瓶颈[3,4]。WHO早在1995年曾建议流感疫苗生产企业使用哺乳动物细胞培养来替代鸡胚培养以进行流感疫苗生产[3]。相对于鸡胚培养，基于细胞培养的流感疫苗的优势主要体现在:摆脱了对鸡胚供应的依赖;工艺易于自动化、规模化;疫苗病毒株在细胞中传代突变几率低，疫苗抗原性更接近自然流行株;工艺采用相对密闭的生物反应器系统，可有效降低微生物污染风险;疫苗不含卵清蛋白，可降低接种后过敏反应风险[3,4,5]。近年来，基于不同类型细胞基质的季节性流感疫苗和大流行流感疫苗已在不同国家和地区获批上市，为流感流行和大流行的有效防控提供了重要支持(见表1)。

　　1 基于不同细胞基质的流感疫苗概况

　　1.1 基于MDCK细胞培养的流感疫苗

　　犬肾传代细胞(Madin Darby canine kidney,MDCK)是研究人员于1958年从一只成年雌性cocker spaniel犬的肾脏组织中分离获得，该细胞于1964年保存于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，命名为ATCC CCL-34[6]。MDCK细胞对不同型和亚型流感病毒株都具有广泛的敏感性，且可以实现病毒的有效扩增，是目前用于流感病毒分离、培养和感染性滴度检测的主要细胞系。MD-CK对于流感病毒的广泛适应性也使其成为了基于细胞培养的流感疫苗研发的重要细胞基质。2001年，Solvay公司采用无血清微载体贴壁培养的MD-CK细胞研制的三价流感病毒亚单位疫苗(Influvac)在荷兰获得上市批准，但因供应延迟未能正式上市[5]。2007年，由Novartis公司研制的基于无血清悬浮培养MDCK细胞(MDCK-33016PF)的三价季节性流感亚单位疫苗(Optaflu)获得EMA的上市许可，该疫苗随后于2012年12月正式获得FDA批准，并将商品名变更为Flucelvax。2015年，CSL公司收购Novartis流感疫苗业务后，Flucelvax由CSL公司旗下的Seqirus公司接管，2016年5月，Seqirus的四价流感疫苗获得美国FDA批准用于4岁及4岁以上人群流感预防。2019年1月，EMA也正式批准四价Flucelvax用于9岁及以上人群流感预防[6]。此外，韩国SK Chemicals研发的基于无血清悬浮培养MDCK细胞的三价和四价季节性流感亚单位疫苗也分别于2014年和2015年获批在韩国上市[7]。目前Green Cross,Astra Zeneca等公司开发的基于MDCK细胞培养的不同类型流感疫苗正处于临床试验阶段[8,9]。

　　1.2 基于Vero细胞培养的流感疫苗

　　非洲绿猴肾(African Green Monkey,Vero)细胞是1962年由日本科学家利用正常成年非洲绿猴肾脏细胞建立[10,11]。Vero细胞是WHO和《中华人民共和国药典》认可的可用于疫苗生产细胞系，并已用于多种病毒类疫苗的生产。研究表明Vero细胞对不同型和亚型的流感病毒也具有较为广泛的敏感性，但其病毒扩增效率低于MDCK细胞和鸡胚[10,12]。Baxter公司利用Vero细胞微载体无血清培养系统开发的H5N1大流行储备疫苗和09甲型H1N1大流行疫苗(Celvapan)于2009年获EMA批准上市，基于Vero细胞的三价季节性流感病毒裂解疫苗(Preflucel)分别于2010年和2011年先后获奥地利和EMA批准上市，但因接种后疑似预防接种异常反应增加，EMA最终对Preflucel进行了召回处理[3]。

　　1.3 基于EB66细胞培养的流感疫苗

　　EB66细胞是法国Valneva公司的专利细胞系，该细胞是从鸭胚胎干细胞中提取并驯化获得的稳定传代细胞，EB66细胞未经化学诱导和遗传修饰，可在无血清培养基或化学成分界定的培养基中进行全悬浮培养。研究显示EB66细胞具有很好的生长特性，细胞倍增时间约为12～14 h，最高细胞密度可达到3×107个·m L-1[11,13]。2014年，由日本化学及血清疗法研究所和GlaxoSmithKline合作开发的第一个基于EB66细胞的H5N1大流行储备流感疫苗在日本获得上市许可[4]。

　　1.4 基于PER.C6细胞培养的流感疫苗

　　PER.C6?细胞是荷兰Crucell公司专利细胞系，该细胞是将人腺病毒5型早期基因E1(Ad5 E1)转染原代培养的人胚胎成视网膜细胞后获得稳定传代细胞系。PER.C6?细胞可适应于无血清、无动物源蛋白的培养基，并可在生物反应器中进行全悬浮培养，细胞密度可达到107个·m L-1以上，接种不同型和亚型的流感病毒进行培养后，细胞上清中病毒感染性滴度可达到7.6～10 lgTCID50·m L-1，具有较高的扩增效率[11,14]。目前Sanofi Pasteur开发的基于PER.C6?细胞的人用H7禽流感疫苗已完成Ⅰ期临床试验[4]。

　　1.5 基于其他新型候选细胞系的流感疫苗研究

　　近年来，研究人员也在尝试开发一些适合流感疫苗生产的新型候选细胞基质。PBS-1细胞是一种永生型鸡胚肾细胞，微载体贴壁培养的PBS-1细胞对甲型和乙型流感病毒均具有较好的敏感性，可在不需要TPCK-胰酶的情况下实现流感病毒野毒株的高滴度扩增，病毒感染性滴度>6.85 lg TCID50·m L-1[4,11]。AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞分别是转染人Ad5E1及E1和pIX基因的鸭传代细胞，无血清悬浮培养的AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞密度可达到3.0～7.7×106个·m L-1，感染流感病毒A/PR/8/34(H1N1)后细胞上清流感病毒血凝滴度可达到2.5lgHAU·100μL-1[4,11]。CAP细胞系来源于人羊膜细胞，通过转染人Ad5 E1和pIX基因获得永生化能力，研究表明不同型和亚型的人和动物流感病毒在通过扩增条件优化后，病毒血凝滴度可高达3.2lgHAU·100μL-1[11,13]。DuckCelt?-T17细胞系来源于原代鸭胚胎细胞，通过转染人Ad5 E1A基因获得永生化能力，Duckcelt?-T17细胞在无血清悬浮培养条件下细胞密度可达6.5×106个·m L-1。通过对近20株人、禽流感病毒的细胞感染实验显示，绝大多数流感的感染性滴度超过5.8 lgTCID50·m L-1，最高滴度可达9.05 lgTCID50·m L-1，且病毒在感染后24 h即可达到最大滴度，这将有望大大缩短工艺时间[13]。最近，ProBioGen公司报道了其开发的一株永生型猪肾细胞系PBG.PK2.1，该细胞在化学成分界定培养基中培养最高密度可达到5×107个·m L-1，接种流感病毒后的大最血凝滴度达到3.93lgHAU·100μL-1[15]。以上新型细胞系均具有成为流感疫苗生产用基质的潜能。

　　2 基于细胞培养的流感疫苗工艺研究及质量控制

　　2.1疫苗工艺研究

　　基于细胞培养的流感疫苗主要工艺流程包含细胞培养、病毒扩增、病毒灭活和裂解、病毒纯化和制剂等过程。建立高效的流感病毒扩增系统是基于细胞培养的流感疫苗生产的关键步骤。在起初的细胞培养工艺研究主要采用含血清培养系统，Hu等[16]在生物反应器中采用微载体Cytodex 1、含血清培养基培养MDCK细胞(ATCC CCL-34)，细胞最高密度可达到0.8×107个·m L-1，接种H5N1流感病毒(A/Vietnam/1194/2004-NIBRG-14)后细胞收获液血凝滴度达到2.9 lgHAU·100μL-1，病毒感染性滴度达到8.64～9.22 lgTCID50·m L-1，上清液中HA含量最高可达11.74μg·m L-1。有研究者在生物反应器中采用微载体Cytodex 1、含血清培养基培养Vero细胞(ECACC 88020401)并进行了H1N1流感病毒(A/PR/8/34)感染实验，细胞上清病毒血凝滴度为2.6 lgHAU·100μL-1，病毒感染性滴度为7.83～7.88 lgTCID50·m L-1。

　　近年来，鉴于动物源性血清的潜在污染风险和成本控制问题以及不断提升的质量监管要求，采用无血清培养成为流感病毒扩增工艺的主要趋势。有研究者比较了MDCK细胞在含血清和无血清培养体系中流感减毒活疫苗毒株的扩增效率，结果表明在2种培养体系中不同流感病毒株均能够有效扩增，最高滴度可达到5.2～7.8 lg TCID50·m L-1，并建立了2 500 L生物反应器规模的MDCK无血清贴壁培养流感病毒工艺。Baxter在6 000 L生物反应器中建立了Vero细胞(ATCC CCL81)无血清微载体(Cytodex3)培养工艺，细胞密度达到了2.73×106个·m L-1，接种A/Vietnam/1203/2004和A/Indonesia/05/2005流感病毒后，病毒血凝滴度2.70～3.01lgHAU·100μL-1、感染性滴度达到8.6～9.0 lg T-CID50·m L-1，实现了流感病毒的高效扩增[11]。

　　无血清悬浮培养由于操作简便、易于放大、成本较低、稳定性高等优势，为流感病毒的大规模高滴度扩增提供了更加高效和便捷的工艺方案。Huang等[17]研发了一种适宜于MDCK悬浮培养的无血清培养基，细胞密度可达到5.97×106个·m L-1,H1N1病毒感染后血凝滴度可达到3.88 lgHAU·100μL-1、病毒感染性滴度可达到10.34 lgTCID50·m L-1，表明无血清悬浮MDCK细胞培养体系用于流感疫苗生产的巨大潜力。Novartis通过驯化获得1株适应于无血清、无蛋白悬浮培养适应的细胞株MD-CK33016-PF，在搅拌槽式反应器实现了1 000 L以上规模的培养，并成功用于该公司季节性流感疫苗和大流行疫苗的生产[5]。目前，利用动物细胞培养进行流感病毒扩增主要采用批次培养工艺，Bissinger等[18]设计了一种半灌注培养体系，在该体系中MDCK细胞密度可达到6×107个·m L-1，累积收获的病毒液血凝滴度为4.5 lgHAU·100μL-1，病毒感染滴度可达10 lgTCID50·m L-1，为更高效的流感病毒扩增工艺建立提供了参考。

　　相对于鸡胚来源的流感疫苗，基于细胞培养的流感疫苗需要相对较复杂的下游工艺流程以去除宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)和DNA等非有效成分。一般而言，细胞收获液首先需通过离心或过滤等方式除去细胞碎片(或微载体)以达到澄清目的。随后再进行病毒灭活处理，甲醛和β-丙内酯(beta-propiolactone,BPL)是目前广泛使用的2种化学灭活剂。有研究表明使用BPL灭活还有助于将宿主细胞DNA片段控制在300 bp以下[19]。此外，核酸酶(benzonase)的使用可有效降低下游工艺过程中的宿主DNA含量。细胞培养来源的流感病毒纯化主要利用多步层析技术进行，纯化工艺开发过程中一般以血凝素(hemagglutinin,HA)回收率、HCP和DNA去除率以及工艺效率等指标进行评估。Kalbfuss等[20]利用过滤澄清、BPL灭活、超滤浓缩、分子筛层析(Sepharose 4 FF)、离子交换层析(Q Sepharose XL)和超滤透析工艺开展了基于MDCK细胞培养的流感病毒纯化工作，结果显示其整体蛋白回收率为52%，宿主DNA去除率达到99.8%，疫苗宿主细胞DNA残留为500 ng·剂-1，未达到WHO规定的10 ng·剂-1的标准。Tseng等[21]开发了包含过滤澄清、甲醛灭活、微滤、超滤、阴离子交换层析和辛胺配基复合模式层析为主的下游工艺，结果显示利用该工艺纯化基于不同培养体系(Vero或MDCK细胞)的多株流感病毒的HA回收率达到33%～46%,HCP和DNA总去除率分别超过96.1%和99.7%，单价疫苗(15μg HA·剂-1)宿主细胞DNA残留可降低至30～130 pg·剂-1。近年来，一些新型层析介质和层析技术，如基于lectin的亲和层析、膜层析技术以及Monolith整体柱等开始用于细胞基质流感疫苗的纯化研究中，将使得基于细胞培养的流感疫苗下游纯化工艺变得更加高效便捷[22,23]。

　　2.2 疫苗质量控制

　　基于细胞培养的流感疫苗的质量控制比鸡胚来源的流感疫苗相对复杂。一方面，用于疫苗生产的细胞库需进行全面检定并符合相关法规要求。另一方面，疫苗原液、半成品、成品检定过程中还须包含更多的工艺特异性指标，如HCP,DNA以及工艺添加物(如核酸酶)残留等。Seqirus公司上市的四价流感疫苗相关残留物标准为HCP≤25.2μg·剂-1，裂解剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)≤18μg·剂-1，吐温-80≤1 500μg·剂-1，宿主DNA<10 ng·剂-1,BPL<0.5μg·剂-1[24]。

　　3 基于细胞培养的流感疫苗临床安全性和免疫原性

　　1997年，Solvay首次报道了MDCK细胞和鸡胚来源的流感疫苗在18～57岁人群中的安全性和免疫原性临床试验结果，表明2种疫苗具有相似安全性和免疫原性[12]。Optaflu(Flucelvax)作为第一个获EMA和FDA批准并成功上市的三价季节性流感亚单位疫苗，其在不同年龄段人群中的安全性和免疫原性已在至少3项Ⅰ，Ⅱ期临床试验和10项Ⅲ期临床试验中被证实[5,24,25]。一项涉及3 604例3～17岁儿童的Ⅲ期临床试验结果表明，Optaflu具有良好的免疫原性，非劣效于鸡胚流感疫苗。9～17岁儿童在接种Optaflu后，血清血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)抗体的血清阳转率、几何平均滴度(geometric mean tite,GMT)增长倍数以及血清保护率与鸡胚来源流感疫苗无显着差异，均符合欧洲药品管理局人用医药产品委员会(European Committee for Medicinal Products for Human Use criteria,CHMP)标准。尽管在4～8岁儿童中，2种疫苗针对部分毒株(甲型H3N2或B型)的血清学指标不能完全符合CHMP标准，但这可能与HI抗体检测时所有的抗原来源有一定的相关性。在安全性方面，细胞流感疫苗与鸡胚流感疫苗的不良反应发生率相当，主要表现为注射部位疼痛和红斑，均未发现疫苗相关严重不良反应。此外，四价流感疫苗Flucelvax在Ⅲ期临床试验结果也显示出其对共有三价病毒株的非劣效性以及单一B型病毒的优效性结果[6,25]。Optaflu在成人(18～60岁)和老年人群(≥61岁)中的安全性和免疫原性临床试验结果也表明，细胞流感疫苗与鸡胚流感疫苗安全性和免疫原性相当[5]。Frey等[26]还进一步报道了细胞基质流感疫苗对实验室确诊流感病例的保护效力，在这项涉及11 404例18～49岁受试者的临床试验中，监测分析了接种细胞基质和鸡胚来源的流感疫苗后对当季流感流行季流感确诊病例的保护效果，试验结果显示:细胞基质流感疫苗对疫苗匹配病毒株和所有流行株引起的实验室确诊病例的保护效力分别为83.8%和69.5%，鸡胚疫苗的保护效力分别为78.4%和63.0%,2种疫苗临床保护效力相当。

　　在Baxter开展的一项基于Vero细胞培养的三价季节性流感病毒裂解疫苗的保护效力、安全性和免疫原性的多中心、随机、双盲、安慰剂对照的Ⅲ期临床试验中，7 250例18～49岁受试者按照1∶1的比例分为疫苗组和安慰剂组。结果表明:基于Vero细胞的三价流感裂解疫苗对疫苗匹配病毒株引起的实验室确诊病例的整体保护效力为78.5%。且疫苗耐受性良好，只观察到轻微和短暂的不良反应，未发现严重不良反应。此外，通过进一步分析发现，HI抗体滴度≥1∶15可能与Vero细胞基质流感疫苗在该年龄人群中的保护性相关[3]。Vero细胞流感疫苗在50～64岁和65岁以上人群中的安全性和免疫原性也被证明与鸡胚流感疫苗相当[12]。作为大流行流感疫苗开发策略之一，基于MDCK细胞、Vero细胞和EB66细胞的大流行流感疫苗(如H5N1,09H1N1,H7N1等)的安全性和免疫原性也已分别被证实或正处于临床试验评价过程中[4]。

　　值得注意的是，在2017—2018年南半球流感流行季，有监测显示细胞基质流感疫苗比鸡胚流感疫苗在不同人群(尤其是老年人群)中表现出更高的保护效力。初步分析表明，可能是H3N2流感病毒在鸡胚中的传代适应性突变导致了其与流行株抗原性的差异，导致鸡胚流感疫苗接种人体后产生的抗体对流行株的中和能力下降，从而造成疫苗保护结果降低。而Seqirus公司于2017年获得美国FDA批准使用MDCK细胞分离的候选疫苗病毒株进行疫苗生产，避免了疫苗毒株的传代适应性突变，疫苗抗原性更接近于流行病毒株，疫苗也因此显示出更好的保护效果[27,28]。

　　4 基于细胞培养的流感疫苗研发的若干关键问题

　　在最近流行季中，基于细胞培养的流感疫苗的临床保护效力相对于鸡胚流感疫苗表现出了一定的优势，细胞基质流感疫苗也因此引起了业界的进一步关注。然而，在当前情况下，WHO流感疫苗生产配套体系主要服务于鸡胚培养的流感疫苗生产。一方面，鸡胚高产的重配疫苗病毒株在动物细胞中的扩增效率有待进一步提高。另一方面，某些鸡胚来源的流感疫苗株(如H3N2)在制备过程中可能已发生了适应性突变，利用鸡胚来源的疫苗株在动物细胞中生产流感疫苗，其疫苗抗原性可能与流行株也有一定差异。2017—2018年流行季，细胞基质流感疫苗较好的保护效力很大程度上与该疫苗生产首次采用了MDCK细胞来源的疫苗株有关[27,28]。有报道表明通过连续传代、基因改造等方法可提高病毒在细胞中的扩增效率，这也将为细胞高产疫苗株的研发提供参考[4,29]。此外，利用鸡胚来源的抗原和血清标准品进行细胞基质流感疫苗HA含量检测也存在一定的不确定性。目前，WHO也在积极推进细胞基质流感疫苗配套体系建设，如多个WHO流感参比和研究合作中心已制备出用于细胞流感疫苗研发的细胞来源的疫苗毒株和部分细胞来源的标准品[30]，将为细胞基质流感疫苗的研发与产业化提供支撑。

　　几十年来，全球科学研究机构和实验室将MD-CK细胞广泛应用于流感病毒的分离、培养和实验室诊断，然而MDCK细胞作为传代细胞系用于疫苗生产，其潜在的成瘤性、致瘤性以及外源因子污染风险成为广泛关注的问题。与大多数传代细胞一样，贴壁MDCK细胞通过皮下接种免疫缺陷小鼠(裸鼠)时具有成瘤性，但细胞裂解物和DNA在多种动物模型中均未见致瘤性。ATCC来源MDCK细胞中也未检出犬腺病毒、犬乳头状瘤病毒、疱疹病毒或和多瘤病毒等病毒DNA的存在。结合细胞基质流感疫苗的制备工艺过程，单剂流感疫苗中存在的完整MD-CK细胞的理论概率为1/1034[19]。因此，基于目前的检测手段利用MDCK细胞作为细胞基质制备疫苗具有较高的安全保证。

　　总结与展望

　　随着全球流感防控能力建设步伐的加快和流感疫苗产品需求的不断提升，高效、稳定、可控的细胞基质流感疫苗生产技术已成为流感疫苗技术创新的重要趋势。2019年3月WHO发布了《2019—2030年全球流感战略》，其中指出针对当前基于鸡胚的传统流感疫苗存在的潜在不足，需要积极优化目前流感疫苗生产技术，其中涵盖了细胞基质流感疫苗技术。近年来，细胞基质流感疫苗研发与产业化取得了较大进展，然而相对于成熟的传统鸡胚流感疫苗，细胞基质流感疫苗在疫苗毒株和标准品等配套体系建设、高效生产工艺研发与优化、工艺成本控制、上市后安全性监测以及疫苗在婴幼儿中的安全性和免疫原性评价等方面尚面临较多问题需要解决。笔者相信，随着各项研究工作的深入和临床评价的推进，基于细胞培养的流感疫苗生产技术将会得到更大范围的推广和普及，细胞基质流感疫苗也将会为流感流行和大流行更加有效的防控提供重要支撑。

　　参考文献
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　　细胞培养论文（专业范文8篇）之第二篇：3D细胞培养在药物研发中的研究进展

　　摘要：3D培养模型的引入是细胞培养技术的一个里程碑, 随着新型支架、基质的发明与应用及细胞成像和分析系统的日新月异, 三维细胞培养可模拟体内微环境而获得传统2D细胞培养所没有的优势, 已在基础研究、干细胞及组织工程等领域崭露头角。本文通过回顾3D细胞培养在药敏实验、药物筛选、药物研发、临床应用中的贡献, 从药物效应、药物代谢及药物敏感性着手, 枚举3D细胞培养通过改变基因/蛋白质差异表达来进行药物研发, 并对其应用趋势、潜在优势和不足作一综述, 为基础研究和临床应用提供理论依据。

　　关键词：3D细胞培养 (TDCC) ,药物研发,药物效应,药物代谢,药物敏感性

　　新靶标的发现及发挥作用的分子与化合物的合成是药物研发的基础与重中之重, 药代动力学和毒性效应是它们的作用机制[1,2]。技术的进步和学科之间的交叉渗透, 使药物发现过程变得不那么繁琐反而更加简易。生物信息学的发展使得药物在体内的代谢、作用及预后等方面可进行体外模拟, 进而确定潜在的药物靶点成为可能。应用生物信息学 (结构建模) 结合药物化学和细胞培养进行的体外药物检测已成为初期药物研发的主要方式, 这种方法不仅有助于节省时间和成本, 还有助于发现针对患者治疗的正误和有效与否。近年, 对三维细胞培养 (three-dimensional cell culture, TDCC) 技术最新进展的报道层出不穷, 主要描述了该模型中癌细胞生长的不同物理特性和信号调控, 癌细胞对药物的敏感性和如何使药物渗透至细胞, 还报道了细胞对抗癌药物的敏感性受到基质性质和使用的细胞类型的影响[3,4,5]。业已证明, TDCC模型结合微阵列和生物信息学对于药物发现和筛选具有潜在的应用前景[6,7,8]。

　　1 TDCC诱导的基因表达和药物效应

　　候选药物在靶细胞中诱导的损伤程度是药物研发的价值体现, 而安全性检测为副作用的发现提供了可能, 是药物筛选的基础。与单层细胞培养相比, TDCC会诱导细胞基因和蛋白的差异表达, 对识别新的药物靶标更具实际意义[9]。

　　Li等[10]对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行了3D细胞培养, 使用微阵列和RT-PCR分析了1766个基因的表达变化, 发现不同基质特性诱导的TDCC可发生特征性变化, 并强调了该研究可直接应用于药物剂量、代谢途径、药效等的检测, 为个体化精准医疗提供最佳治疗结果。另一项关于TDCC诱导的基因表达差异的综合研究是使用了对血管平滑肌细胞的9600个基因的微阵列分析。显示在3D培养物 (也称为球体) 中超过77种与药物重新定位的相关基因发生过表达。Peyton团队[12]将TDCC技术引入平滑肌细胞的培养, 结果显示TDCC中细胞外基质的力学特性可调节Rho A表达和活化, 对细胞增殖具有显着影响, 有助于改善抗增殖药物的使用。

　　Wang等[13]使用胶原蛋白作为TDCC生长基质培养嗅鞘细胞 (OECs) 已显示获得与体内细胞相似的包括形态学、凋亡、增殖等在内与自然微环境生存相关的若干特性。Debeb团队的研究[14]表明应用TDCC技术培养的人类胚胎肾细胞 (293T细胞) 可用于提高药物测试的效用, 对药物靶向具有启示意义, 包括基因TA1, RhoC, N-钙黏素 (N-cathedrin) , vimentin, Notch1, β-catenin, zeb1, slug和snail都存在过表达, 有望成为新的药物靶标。无独有偶, 将人恶性胶质瘤细胞作为3D培养物生长时, 具有DNA修复作用的O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶 (MGMT) 和谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 显示出差异表达, 3D较2D培养更能充分证明MGMT和GST表达不能预测成胶质细胞瘤细胞对烷化剂的敏感性, 而烷基化剂与GST抑制剂的组合揭示了加和效应, 进一步提出了在胶质母细胞瘤治疗中应考虑抑制GST以获得更好的有效性[15]。人卵巢癌细胞SKOV3在微流体芯片上作为3D工程组织培养时, 具有上皮-间质转化 (EpithelialMesenchymal Transition, EMT) 能力, 这些细胞获得了间充质成纤维细胞的形态, 表达了纤连蛋白和N-cadherin的下调, 具有低氧特性, 并表达了上皮肿瘤标志物波形蛋白和CD362/EpCAM, 这些不同的表达可用于探究靶向细胞凋亡和转移的药物[16]。Ghosh团队通过寡核苷酸微阵列分析在多甲基丙烯酸甲酯包被的平板上生长为多细胞球状体的黑色素瘤细胞, 发现超过20, 000个基因的表达, 包括IL-8、CXCL1、CXCL2、CXCL3、ICCL20和ANG等基因显着过表达, 而CD49d和FGF基因的表达减少, 这些结果提示研发肿瘤转移、血管生成和癌症进展的靶向药物成为可能[17]。Debnath和Brugge的研究[18]为形态建模提供了管腔形成、细胞极性和细胞侵入等性质的重要特征, 有助于发现3D培养中基质金属蛋白酶 (MMP) 的过表达和受体酪氨酸激酶 (RTKs) 、集落刺激因子1 (CSF1) 、表皮生长因子受体 (EGFR) 的功能以及导致EMT的途径及其与肿瘤发生和发展相关的机制, 为将3D细胞培养用于更现实相关的药物研发是有利的提供有力的理论依据。这项研究还确定了新的分子在肿瘤进展中的作用, 从而提出精准治疗的潜在靶标。

　　2 高新技术助力3D培养和药物代谢

　　TDCC技术能更加切合体内实际地了解药物在体外的代谢。早在1994年, Boxberger团队[19]就表明, 当使用藻酸盐对人类膀胱癌细胞RT112进行3D多细胞球体培养时, 能够形成良好的内质网和高尔基体, 从而增强细胞发育、功能反应以及体外代谢活动。Lan等[20]研究组采用藻酸盐构建三维支架, 测定单层和3D培养物中包封细胞的Ⅰ期/Ⅱ期细胞活力和代谢特征, 使用扫描电子显微镜 (SEM) 和激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 评估了用肝癌细胞HepG2包裹的超无菌藻酸盐水凝胶在高通量药物筛选中的应用。结果包裹细胞的增殖速率保持稳定, 14天后仍具有>80%的高细胞活力, 并产生CYP1A1和CYP3A4肝特异性酶, 表明细胞的存活力和功能性良好, 且能持续保持Ⅱ期细胞的谷胱甘肽活性。Labonia团队[21]用3D打印流体装置新型体外平台来评估药物的渗透和代谢。其允许三维细胞培养物进行动态给药, 用MALDI成像质谱法 (IMS) 检查化疗药物伊立替康对结肠癌HCT116球状体的渗透。还检测到伊立替康的活性代谢物SN-38经24小时的治疗后, 被浓缩到球状体细胞分裂活跃区 (即外围) , 表明这种独特的体外平台是评估3D细胞培养物中药物渗透和代谢的有效手段。由于其成本效益和高通量, 该创新系统可对候选药物的临床前评估产生重大转变性影响。Feng等[22]利用聚己内酯 (PCL) 和羟基磷灰石 (HAp) 制成具有生物相容性, 且平均孔径167μm的近场静电纺丝 (NFES) 复合支架, 有效提高细胞的增殖和分化, 并可根据PCL与HAp的比例控制降解速率, 有效解决了3D系统不易分离细胞的缺陷。Choi团队[23]研究发现TDCC技术培养的肝细胞样细胞 (HLCs) 药物代谢酶和肝转运蛋白的基因表达显着高于在2D培养的HLCs。此外, 3D培养的细胞显现特异性功能, 包括白蛋白分泌和胆小管形成增加。特别地, 3D球形培养物增加了编码肝酯酶的CES1和BCHE的表达。通过胆碱酯酶活性测定得知HLC对奥司他韦的易感性增加, 证实了这些肝酯酶的活性增强。多项研究证实, 3D球形培养可增强细胞的成熟和药物代谢, 有助于优化药物筛选及毒性检测。

　　3 改变药物对3D细胞培养的敏感性

　　TDCC技术给药效研究领域带来了福音。它的出现已经极大地改变了药物诱导的细胞毒性, 基因毒性, 抗增殖和类似作用的典型“剂量反应”的观点。Castillo等[24]利用TDCC对60个肺癌细胞球状体进行Gefitinib的敏感性探究, 发现EGFR与hedgehog信号通路的G蛋白偶联受体SMO是其敏感性相关的基因, 并证实了吉非替尼与SMO抑制剂Cyclopamine和GDC0449具有潜在的协同作用。3D细胞培养物用于直接测试不同终点或化合物对药物诱导的调节效应, 大多数都针对不同终点的药物测试, 具有显着基因表达变化, 且可用于药物发现的3D细胞培养研究枚举于表1[25,26,27,28]。

　　4 结论

　　细胞培养是药物研发、干细胞和肿瘤研究领域不可或缺的实验对象。三维细胞培养已成为药物研发的宝贵工具, 为细胞的体外药物研发模拟体内微环境, 较2D培养更接近体内真实情况, 有助于弥合体外和体内系统之间的差距, 并可减少在早期发现阶段使用动物的实验次数, 以减少药效等方面的误差。在诸如“组学”工具, 纳米技术和生物打印等高新领域的进步与融合, 势必增强3D细胞培养在药物研发中的实用性。近年来, 研究者们已经探索了自动化, 微流体、芯片及NASA研发改进的微重力旋转三维培养体系, 尽管显现出较2D培养的优越性, 然而, 大多数3D培养物利用凝胶基质, 但由于其固体和不透明性以及细胞暴露于外源信号的不一致性而限制了应用。在没有凝胶基质的3D培养中, 细胞倾向于彼此粘附并在中心形成具有坏死区的团块, 使得它们不易于分析, 因此, TDCC在纳入药物研发、个体化精准诊疗等领域的共识及标准前, 还有很多荆棘与坎坷亟待攻关和解决。

　　参考文献
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