摘 要： 多重PCR技术是一种将常规PCR扩增体系改进后同时扩增多个目的片段的新型技术。多重PCR凭借高通量、低成本、特异性强的特点,迅速被应用于快速检测领域及科学研究领域。简要概述了多重PCR技术,综述了多重PCR技术在病毒检测、细菌检测、血清学检测的应用,并将其与常规技术进行比较,总结了这些方法的优缺点,为今后多重PCR技术在快速检测中的应用选择提供依据。
关键词： 多重PCR; 血清学; 细菌; 病毒; 快速检测;
Abstract： Multiplex PCR technology is a new technique to amplify multiple target fragments at the same time after optimizing and improving the amplification system of conventional PCR. Due to its high throughput,low cost and high specificity,multiplex PCR has attracted much attention in the field of rapid detection and scientific research. This article briefly outlines the application of multiplex PCR in virus detection,bacterial detection and serological detection. We compare the advantages and disadvantages between the common methods and multiplex PCR and summarize the application and prospect of multiplex in rapid detection.
Keyword： multiplex PCR; serology; bacteria; virus; rapid detection;
多重PCR又称复合PCR，是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，即在同一个反应体系中加入两对以上引物，同时在同一模板或不同模板之间进行多个核酸片段的扩增。与常规PCR相比，多重PCR技术拥有单个PCR灵敏性和特异性，又较之快捷和经济，在引物和PCR反应条件的设计方面表现出很大的灵活性。自Chamberlian和Gibbs等人于1988年首次报道通过多重PCR扩增筛选出杜氏肌营养不良基因座的缺失以来[1]，多重PCR技术已被成功应用于基因诊断的多个领域，包括临床病原微生物检测[2]、食品安全的检测[3]、植物基因分型与定量研究[4]和肿瘤用药指导[5]等研究。
随着社会需求的扩大，检测鉴定已不局限于传统检测手段，随着分子生物学检测的崛起，快速检测已成为目前安全检测、检验检疫等领域中的重要组成部分，特别是在全球新冠疫情的影响下，快速检测为社会提供了高效便捷的服务，而利用一次多重PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体/基因型，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值。本文分析了多重PCR在快速检测中的研究进展与应用热点，为完善快速检测手段及应用选择提供参考思路。
1 、多重PCR原理
多重PCR技术是在常规PCR的基础上加以改进后的一种新型技术，其基本原理与常规PCR相同，是通过聚合酶链式反应来达到目的片段的扩增。当DNA双链处于90℃高温时，双链DNA会解旋成单链DNA;当温度降到60℃左右时，引物与特定的靶序列相结合;当温度升到72℃时即为DNA聚合酶的最适温度，在依靠多种d NTPs底物的基础上再通过碱基互补配对原则从而完成单链DNA的延伸工作，最终完成DNA双链的合成[6]。多重PCR与常规PCR的区别在于同一个反应体系中所加入的引物对数不同。多重PCR可以特异性扩增出一条以上的目的DNA片段。反应体系的组成和PCR循环的条件需要经过优化以确保同时扩增多个DNA片段。理论上只要PCR扩增的条件合适，引物对的数量可以不限，但由于各种条件的限制，实际能够扩增的引物对数量是有限的(～1000对)。
2 、多重PCR技术在快速检测中的应用
快速检测是指样品制备简单、所用试剂较少、制备后可保存较长时间、操作过程简单、对操作人员要求较低，且能在较短时间内完成检测分析并得出检测结果的方法[7]。快速检测可快速筛查任何存在问题的产品，能及时发现问题并采取相关措施，以此可避免食品安全事件的发生或生产企业的损失，这对提高监督工作效率和力度，保障社会卫生安全具有重要意义。常用的快速检测方法除了目前有关核酸检测中用到的多重PCR技术以外，还有胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法、电化学分析法等[7]。
目前，多重PCR技术在快速检测中的运用较为广泛，在不同的领域之间也有相关的研究报道。表1总结了近年来部分研究情况，其中，多重PCR技术在细菌检测方面的应用相对较多。
2.1 、在病毒检测中的应用
病毒是一种个体微小，结构简单并且必须依靠宿主细胞进行增殖的非细胞型生物，同时具有在生物体之间进行传播并感染生物体的能力。一旦感染上有害病毒如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、新型冠状病毒等，则会给人类带来疾病甚至威胁生命。多重PCR技术的应用给病毒检测带来便利。张曼等建立鉴别禽流感病毒、新城疫病毒和安卡拉病毒的多重PCR检测方法[17];刘晓萌等采用多重PCR技术检测支气管异物并下呼吸道感染患儿病原菌，病原菌检出率为96.2%，其结果的病原体检出率与分离培养相比，远远大于分离培养的病原菌检测率[41];蔡德丰等使用多重PCR对大肠埃希菌、副溶血弧菌、痢疾志贺菌、肠炎沙门菌及肠道病毒71型腹泻病原体进行检测，结果各样本之间无交叉反应，各腹泻病毒Adv、No V G1、RV A、SV及HAst V的检出限均小于5×103copies/μL,No V G1小于1×104copies/μL，表明该技术的特异性和灵敏度都很高[10]。
2.2 、在细菌检测中的应用
细菌检测中，最为常见致病菌主要包括致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌属的类群(Shigella)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)等。多重PCR技术在细菌检测中应用广泛，白龙等通过优化多重PCR技术，用于检测在多种鸡源细菌中的5种四环素耐药基因[42];谢庆超等构建多重RT-PCR体系检测了92份生食水产品样品的副溶血性弧菌和单增李斯特菌[32];李新福等通过优化多重PCR技术的反应条件检测出低温肉制品中的沙门菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球[31]，其检测结果具有高特异性及高灵敏度的特点，操作也省时省力，为快速检测提供高效便捷的参考办法。
2.3、 在血清学检测中的应用
即使是相同的细菌，不同的血清型给人带来的影响也会不相同。例如大肠埃希氏菌、沙门氏菌，不同的血清型在侵袭力、耐药性、毒素系统以及给出的治疗方案也不相同。郑玉玺等建立对食品中3种常见血清型沙门氏菌快速检测的多重PCR方法[37];左乐等通过建立多重荧光PCR鉴定体系同时检测了常见的15种沙门菌血清型，其方法检出限为1.1×10-3～1.2×10-3ng/μL，检测灵敏度达到1 pg/μL，从核酸提取到结果判定，整个实验过程可在1.5 h内完成[42]，这体现了多重荧光PCR技术较高的特异性、省时省力的特点。
表1 多重PCR技术在快速检测中的应用情况
3 、多重PCR在快速检测中的优势
标准检测法、常规PCR与多重PCR技术都是在快速检测中广泛应用的方法，这三类方法的比较见表2。其中，标准培养检测方法需要增菌、划线培养、染色镜检、平板计数等操作，步骤较多、耗时较长，一般需要5～7 d，但成本较低，操作相对简单。常规PCR方法较标准检测法检测速度提升、操作更简便，且特异性强，但由于提取方法的受限可能会造成假阴性，或死菌DNA的污染易造成假阳性，成本较高，另外还需要PCR仪及凝胶电泳的使用。多重PCR方法优势突出，比常规PCR方法操作更为简便，大大缩短了检测时间，且试剂耗材少。
表2 标准检测法、常规PCR与多重PCR的比较
4 、结论与展望
近年来，随着快速检测的需求越来越大，分子生物学的检测技术也更为广泛地应用，多重PCR技术作为其中便捷的分子生物学手段，由于其具备有高效率、低成本的特点，在快速检测中获得很大的关注，至今已有大量的研究报道。但多重PCR技术仍有些不足之处，一是随着检测重复次数的增加，扩增效率的一致性可能会被降低;二是降低相应引物浓度时，可能会引起假阴性的结果;三是易受到样品中死菌DNA的污染，从而导致假阳性的情况发生，其中，扩增效率的一致性是多重PCR技术广泛运用的一大难题。此外，多重PCR技术也具备有其他方面的优势，高通量，是它最显而易见的特点，一次操作便可扩增出不同的病原体或不同的目的条带。即节省了时间，也节省了成本。未来可在现有的研究基础上将多重PCR技术与其他技术相结合，例如将膜层析技术与多重PCR技术相结合[45]，由于膜层析具有分离混合液的特点，与多重PCR技术相结合后可解决检测结果假阳性的问题或其他相关问题。此外，还可研发一种便于携带且操作简便的检测试剂盒，让检测技术不在局限于实验室，可以随时随地检测，达到实时检测的目的。
(本文文献格式:官昭瑛，李慧敏，何曼文，等．多重PCR技术在快速检测中的应用[J]．山东化工，2021,50(3):85-88.)
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