双酶切联合琼脂糖凝胶电泳是鉴定 DNA 重组成功与否的重要方法[1],琼脂糖凝胶电泳图像质量直接影响鉴定结果的判读、论文发表。条带弥散是图像质量不佳的主要表现之一，研究者多将其归咎于不合理的酶切和不规范的电泳操作[2],而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者在双酶切鉴定葡萄糖6 - 磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydro-genase,G6PD）重组质粒 pET-28a-G6PD 时，发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响，现报道如下，以供参考。
1 材料与方法
1. 1 质粒与菌株
含空质粒 pET-28a 的大肠杆菌 Top10 （pET-28a / Top10）由本教研室保存。重组质粒 pET-28a-G6PD 为笔者构建并转化至 Top10 感受态细胞中。
1. 2 试剂与仪器
质粒小量提取试剂盒、卡那霉素、50 × TAE 电泳缓冲液购自上海生工生物工程有限公司，快速限制性核酸内切酶为 Fermentas 公司产品，琼脂糖为Biowest 公司产品。酵母浸出粉、胰蛋白胨为 OXIOD公司产品。MilliQ 超纯水为 实 验 室 自 制。DNAmarker 为 TAKARA 公司产品。POWER Pac HC 高电流电源为 BIO-RAD 公司产品、GIS 凝胶成像仪为上海天能公司产品，DYCP-31DN 型电泳槽为北京六一仪器厂产品。
1. 3 菌液培养
将含 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的大肠杆菌Top10 分别划线于含 100 μg / ml 卡那霉素的 LB 平板中，37 ℃倒置培养 15 h.挑单菌落各 1 个，接种至 40 ml（装于 250 ml 三角瓶中）含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB 中，于摇床内 37 ℃ 250 r/min 培养，用上述不含菌液的 LB 作为空白对照，用可见分光光度计测定 600 nm 处的菌液的光密度值（OD600），至OD600为 1. 6,停止培养。
1. 4 取
1. 4 ml 菌液抽提质粒
利用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。步骤如下：①分别从各瓶吸取菌液 1. 4 ml 至 1. 5 ml 管心管，室温 10 000 r/min,离心 30 s,弃上清；②加 250μl 溶液 P1,3 000 r/min 涡旋 1 min;③加 250 μl 溶液 P2,温和颠倒混匀 10 次，室温静置 4 min;④加入350 μl 溶液 P3,温和颠倒混匀 10 次；⑤室温 12 000r / min 离心 6 min;⑥取 750 μl 上清于另一 1. 5 ml 离心管，室温 14 000 r/min 离心10 min;⑦取600 μl 上清于吸附柱中，室温 9 000 r/min 离心 30 s;⑧弃滤液，向吸附柱中加500μl WD1,室温10 000 r/min 离心 1 min;⑨弃滤液，向吸附柱中加 500 μl wash buff-er,室温 10 000 r / min 离心 1 min;⑩重复⑨一次；瑏瑡?弃滤液，将吸附柱置于收集管中，室温 13 000 r/min离心 2 min;瑏瑢?将去盖的吸附柱置于灭菌的 1. 5 ml离心管，做好标记，向吸附柱中加入 80μl 灭菌超纯水，室温静置 2 min,13 000 r/min 离心 1 min,收集滤液，冰浴备用。
1. 5 取 2 × 0. 7 ml 菌液抽提质粒
分别从各瓶取菌液0. 7 ml 至1. 5 ml 离心管，平行抽提两份，按1. 4① - ⑥抽提质粒，将⑥后的两份平行抽提的上清各600 μl 收集于1. 5 ml 离心管，于同一吸附柱内分两次进行⑦，后续步骤与 1. 4 相同。
1. 6 取 4 × 0. 35 ml 菌液抽提质粒
分别从各瓶取菌液0.35 ml 至1.5 ml 离心管，平行抽提四份，按 1. 4 中① - ⑥抽提质粒，将⑥后的四份平行抽提的上清各 600 μl 收集于 5 ml 离心管，于同一吸附柱内分4 次进行⑦，后续步骤与1.4 相同。
1. 7 质粒的双酶切反应
1. 4 ml,2 × 0. 7 ml,4 × 0. 35 ml 菌液抽提的pET-28a 经 NanoDrop 2000 测定浓度分别为 116,125,130 ng / μl;pET-28a-G6PD 的浓度分别为 120,134,145 ng /μl.用灭菌超纯水将所有质粒稀释至116 ng / μl.酶切体系：空质粒（ 或重组质粒） 1 μg,Nde Ⅰ、Xho Ⅰ各 1 μl,10 × FD Green Buffer 2 μl,加水至 20 μl.混匀，37 ℃酶切 1 h.
1. 8 双酶切质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定
配制 1. 2% 的琼脂糖凝胶。将 2 μl 1 kb DNAladder marker（与 13 μl 1 × TAE 及 3 μl 6 × LoadingBuffer 混匀）、双酶切的 pET-28a、双酶切 pET-28a-G6PD 全量加入上样孔，130 V 电泳 30 min.
1. 9 质粒纯度的测定
利用 NanoDrop 2000 测定三种策略抽提的质粒pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的 OD260、OD280值，评估质粒纯度。1. 3 - 1. 9 的实验进行 4 次重复（独立实验）。
2 结果
2. 1 双酶切后的质粒电泳图谱
按策略 1. 4,1. 5,1. 6 抽提的质粒酶切后电泳图谱见图1.可知，按1. 4 策略抽提的质粒 pET-28a 和pET-28a-G6PD 双酶切后均严重弥散，尽管第 2 泳道中酶切产生的大片段（略大于5 000 bp）、小片段（介于1 000 -2 000 bp）分别与 pET-28a（5 239 bp）、G6PD分子量（1 548 bp）相符，但其相对亮度与理论不符；按1.5 策略抽提的 pET-28a 酶切后在 <1 000 bp 范围内弥散明显减少，pET-28a-G6PD 酶切后的弥散有明显改善，大片段的亮度明显高于小片断；按 1. 6 策略抽提的 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 酶切后的弥散几乎完全消失，pET-28a-G6PD 酶切产生的大、小片段亮度比值接近理论值。
2. 2 质粒纯度测定
策略1. 4,1. 5,1. 6 抽提的质粒 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的 4 次实验的 OD260/ OD280平均值分别为1. 36 和 1. 45,1. 65 和 1. 70,1. 75 和 1. 78.可见，菌液越少，质粒的纯度越高，所含蛋白杂质越少。
3 讨论
质粒的双酶切和琼脂糖凝胶电泳的原理简单，易于掌握；但要获得理想的琼脂糖凝胶电泳图片，需要在多个环节上下功夫。导致电泳图片效果不佳的原因很多，有些无法从文献找到答案，需根据具体情况分析，并用实验检验。酶切后弥散是琼脂糖凝胶电泳常见的实验现象之一，导致弥散的原因有：①质粒 DNA 中含有 DNase,在酶切缓冲液的 Mg2 +作用下激活，水解质粒[3].②不正确的酶切，如酶用量过多、酶切时间过长、酶切缓冲液错误，导致质粒被切碎。③不合理的电泳缓冲液，如缓冲液陈旧、缓冲液配制错误（如 pH 和盐离子浓度错误）。④琼脂糖凝胶配制错误。
本研究所用菌株 Top10 为 end A （编码非特异性 DNA 内切酶Ⅰ）突变型，同时溶解质粒的超纯水均为灭菌后一次使用，可排除 DNA 酶对质粒的降解。随着优质的限制性内切酶及其通用缓冲液的出现，酶切操作极为简便，不正确酶切发生的概率很小。即用型商品化电泳缓冲液的推出，极大减少了因缓冲液和琼脂糖配制错误所致的弥散。为此，笔者推测电泳弥散与上述四个原因无关，可能是质粒纯度低所致。
虽然试剂盒法提取质粒速度快、纯度高[4],但仍有不少细节需要在操作时注意。如说明书要求取过夜培养的菌液 1. 5 - 5 ml 用于质粒的抽提，其中过夜培养是一个模糊时间，8 - 16 h 均可认为是过夜培养，不同过夜培养时间导致的菌液浓度相差悬殊。此外接种时菌落的生长状态和大小，以及菌株的生长速度均会导致相同培养时间菌液浓度不一。
故需要摸索菌液用量，调整抽提策略，而不能"尽信书".在按照 1. 4,1. 5,1. 6 的策略抽提时，发现向1. 4 ml 菌液所含菌体中加入溶液 P2 裂解后，需要在颠倒混匀后静置 4 min,菌体才变为透明的溶液；用 0. 7 ml 或 0. 35 ml 菌液抽提质粒时，加入溶液 P2颠倒混匀后，立即变为澄清溶液，无需静置，且三种策略裂解的菌液澄清度依次增加。如只取 1. 4 ml菌液抽提质粒，不进行菌液用量的比较，很容易认为1. 4 的透明溶液就是澄清溶液，就继续后续的操作步骤。
如不测定质粒纯度，贸然进行酶切操作，极易导致酶切鉴定图片质量不佳，甚至导致无法观察到酶切产生的目的条带，严重影响结果的判断。同时，不纯的重组质粒严重影响测序[5].纯度测定表明，等量的菌液分成小份多次抽提所得到的质粒纯度逐步提高，酶切后电泳弥散现象逐步消失。其原因可能是分次抽提时，菌体充分裂解，蛋白和基因组 DNA充分变性，在加入溶液 P3 后变性的蛋白和基因组DNA 沉淀更完全，故蛋白质和基因组 DNA 污染减少；同时因裂解单位质量的菌体所用的溶液 P1（含有 RNA 酶）增多，RNA 也清除得更彻底。
总之，通过本文的研究，笔者发现采用双酶切联合琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒时，质粒的抽提策略对酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响。用过多的菌液抽提质粒，因裂解不充分，导致菌体蛋白等杂质难以去除，所提质粒纯度低，易导致双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散。
参考文献：
[1] 蒋俊豪，贺修胜。 PCR - 双酶切鉴定 STGC3 抑癌基因重组子假阳性研究[J]. 现代生物医学进展，2007,7（6）：819 -823.
[2] 曹秀华，王亚婷，李丽，等。 琼脂糖凝胶电泳的条件优化-质粒DNA 重组片段的限制性内切酶谱鉴定[J]. 齐齐哈尔医学院学报，2011,32（01）：9 -11.
[3] 萨姆布鲁克 J,拉赛尔 DW. 分子克隆实验指南[M]. 3 版。 黄培堂，译。 北京：科学出版社，2002:35.
