干细胞移植治疗心肌缺血可以促进梗塞心肌的血管增生、减少心肌梗塞的面积，改善心肌功能。被移植的干细胞进入心肌缺血体内，到达缺血部位后，可以通过变形、游走方式进入缺血组织，在缺血缺氧环境下分化成血管内皮细胞。
干细胞同时可以分泌各种血管因子，如Angiopoitine-1,(vascular endothelial growth factor,VEGF）等，其中还包括胎盘生长因子(Placental growth factor,PlGF)。PlGF因子是家族中的一员，PlGF已经被证实在大脑、下肢缺血动物模型中具有促进新的血管生成，改善局部循环的血流状态的作用。本实验中，在心肌缺血发生后一周后，静脉移植人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）及PlGF基因修饰的hMSCs（PlGF-hMSCs），并在移植后一个月观察大鼠心肌PlGF蛋白表达水平以及血管增生情况。在本实验中，hMSCs和PIGF高分泌功能的PlGF-hMSCs，在心肌缺血的一周后给与静脉注射移植，并在移植后的一周、一个月观察大鼠心肌PlGF蛋白表达水平以及血管增生情况。
1、材料和方法
1.1干细胞培养及腺病毒转染
将健康人志愿者的间充质干细胞放入10%FBS的DMEM/F12培养液内，置于37℃，5%的CO2孵箱培养。本实验采用腺病毒进行转染，即hMSCs按照2×106浓度接种于10%FBS的DMEM/F12培养液中，与预先制成的AxCAhPlGF-F/RGD或AxCALacZ-F/RGD腺病毒质粒混合60分钟进行转染，细胞感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为3×103。使用DMEM清洗后常规保存24小时，准备移植使用。
细胞移植之前离心收集。
1.2大鼠心肌缺血模型
选取体重280-320g雄性Sprague Dawley大鼠,氯胺酮50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于手术台，气管插管，行呼吸机支持。开胸，打开心包暴露心脏，找出冠状动脉左前降支，结扎左前降支根部，逐层关闭胸腔。60min后松开活结，使冠状动脉血流再通。随机分为3组:对照组(DMEM组)6只;hMSCs移植组6只；PIGF-hMSCs组6只。动物用戊巴比妥(30mg/kg)腹腔麻醉，行左侧开胸术暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支。关胸后放回笼中饲养。术后一周后使用股静脉注射方法静脉移植。每只大鼠经静脉移植hMSCs数目为2×106。
1.3PIGF蛋白测试
体外转染hMSCs48小时后，离心提取上清液。使用PlGFELISA(enzyme-linked、immunosorbent、assay)试剂盒(R&DSystemsInc.,Minneapolis,USA)进行测试。
1.4心肌梗塞体积测定
心肌梗死后一月取出大鼠心脏。生理盐水洗洗净，放置-20℃冻存2min，从心尖至心底横切成1mm厚的心室组织切片。将切片置于1%TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)溶液中，在37℃条件下进行染色。则非心肌梗死区染色为红色，梗死区不染色。数字成像后，接入电脑图像分析系统测定左室及梗塞区面积与正常侧的面积百分比。
1.5观察测定血管新生
移植后一个月，全麻状态下静脉注射异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITCdextran）（Sigma）1ml，然后将大鼠开胸取出心脏，浸入4%福尔马林4℃保存48小时。制成100μm厚切片，在共聚焦显微镜（LSMPascal;Carl、Zeiss）20倍物镜下观察心肌缺血的交界处。扫描视野为512×512像素（651.5μm×651.5μm）,扫描厚度2.4μm，并使用ZeissLSM软件计算出毛细血管体积，每个层面取五个视野计算平均值。最后用患侧毛细血管体积与健侧相同位置毛细血管体积相比，得出数值进行分析。
1.6免疫染色
观察PlGF-hMSCs在发生梗塞的心肌是否分化成血管内皮细胞，在大鼠心肌梗塞1周后静脉移植LacZ标识的PlGF-hMSCs。移植后一个月，取出大鼠心脏，用4%福尔马林浸泡24小时后冷冻。切成10μm后的切片。双重染色法染色。使用的抗体包括β-galactosidase(rhodamine-labelled polyclonal rabbit anti-b-galactosidase anti-body,DAKO)和抗体[FITC-labelled polyclonal rabbitanti-von Will-brand Factor(vWF),DAKO]。图片合成由Zeiss软件完成。观察使用共聚焦显微镜观察LacZ转染的PlGF-hMSCs在缺血心肌的分布情况。
统计分析
统计每组数据,数据以平均值±标准差的形式表示，实验组间的数据用SPSS10.0统计软件分析比较，P值<0.05为有统计学意义。
2、结果
PlGF在各组的invitro值，在MOI分别为300,1000,3000的条件下，PlGF测得Lacz-hMSCs组依次为0.05±0.02；0.07±0.03；0.15±0.08ng/105cell/48hr；PlGF-hMSCs组的PlGF蛋白表达量依次为：1.45±0.17；2.14±0.35；5.12±0.72ng/105cell/48hr。PlGF-hMSCs组的PlGF蛋白表达量明显高于LacZ-hMSCs对照组，并且MOI在3000时，PlGF蛋白表达量为最高（表1）。
大鼠心肌梗塞一周，静脉移植后一个月后心肌梗塞体积与健侧的百分比，DMEM、hMSCs、PlGF-hMSCs各组（n=6）分别为49.50±4.50%；41.73±2.05%；33.02±3.71%。据以上结果可以看出，hMSCs以及PlGF-hMSCs移植后，心肌梗塞体积缩小，并且PlGF-hMSCs缩小得更加明显。差异具有统计学意义（p<0.05）（表2）。
大鼠心肌梗塞一周，静脉移植后一个月后得出患侧与健侧的毛细血管比值。DMEM、hMSCs、PlGF-hMSCs各组的比值分别为0.2±0.05；0.69±0.093；1.45±0.47。hMSCs及PlGF-hMSCs移植后，梗塞边界处毛细血管新生明显，PlGF-hMSCs组的毛细血管新生更为明显。差异具有统计学意义（p<0.05）（表3）。
大鼠心肌梗塞一周，经静脉移植LacZ-hMSCs细胞，一个月后对心肌切片进行双重免疫染色。可见移植的hMSCs分化成为血管内皮细胞（图1）。
讨论通过以上实验，我们证实了在心肌梗塞的亚急性期（一周），经静脉移植hMSCs及PlGF-hMSCs后，可以提高梗塞区域的PlGF表达，促进血管新生，缩小心肌梗塞体积。以往的相关实验证实了当心肌或下肢缺血后给予PlGF因子可以促进产生“母血管”，而后再逐渐形成稳定的、增大的成熟血管。具有这样特征的血管的功能可以持续保留至少一年，或者更长的时间。而PlGF与同类血管增生因子如VEGF、Ang-1相比，有着可以避免组织水肿、纤维素沉积以及新生血管稳定性差的情况。尽管国内外有很多关于各种因子转染干细胞移植治疗心肌梗塞的报道，但是使用PlGF因子转染干细胞治疗心肌梗塞尚属首次。有关研究报道了PlGF在缺血组织的过量表达，提示了PlGF因子有可能在治疗组织缺血方面起着重要的作用。
而本实验结果也证实了我们的假设。
我们选择了亚急性期进行移植，在梗塞缺血发生的急性期，毛细血管结构仍然完整，而到了亚急性期，缺血区域的毛细血管壁会出现通透性增加，这样干细胞携带PlGF会有更多机会进入缺血区域，从而发挥更大的治疗作用。同时还考虑到在实际临床治疗中，患者在急性期发病一般需要采取介入支架治疗或溶栓等治疗。所以未来细胞移植成为一种临床治疗手段时，在患者心梗发生的亚急性期可能有更大的使用空间。我们有充分的理由期待PlGF基因转染干细胞在将来的心肌梗塞的治疗中发挥重要的作用。
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