不育不孕症严重影响到一个家庭的和睦及幸福，随着科技及化工业的发展，不育不孕症患者越来越多，成为本世纪严重危害人类生殖健康的疾病之一。
据世界卫生组织（WHO）统计，全世界育龄夫妇中大约有15%存在生育问题（WHO1987年），这部分人群中有50%不育与男性因素有关，而由遗传缺陷因素所引起的生精障碍约占男性不育因素的30%。男性不育患者中Y染色体长臂无精子症因子（azoos-permiafactor，AZF）区微缺失被认为是最重要的非梗阻性无精及少精症因素之一，现代分子生物学和细胞遗传学的研究亦证实了与精子生成相关的AZF基因存在于Y染色体长臂q11区，目前将Y染色体AZF区分为4个区位，分别为：AZFa区、AZFb区、AZFc区和AZFd区，其中任何一个区域座位点的微缺失都可导致生精障碍，造成少精或无精而导致男性不育，其微缺失引起的男性不育发生率仅次于Klinefelter综合征，并且在进行辅助生殖技术卵胞质内单精子注射（ICSI）过程中能将这种遗传缺陷传递给男性下一代，因此在进行ICSI治疗之前进行Y染色体微缺失检测具有重要的临床及理论意义。
本研究对来我院诊治的332例男性精子异常患者及100名已育男性进行外周血Y染色体AZF微缺失基因检测，现总结分析报告如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
病例组：选择2011年7月至2014年1月到我院生殖中心诊治的不育男性患者（年龄20～46岁），诊断标准：女方检查正常，结婚1年以上，未采取避孕措施且夫妻生活正常的情况下不能生育的非阻塞性男性患者，在排除了其他原因如感染等原因后对其进行精液常规分析，按照WHO精液分析标准分类：精子密度<20×106/mL者为少精症患者；患者每间隔7~14d留取精液检测1次，连续3次未发现精子，进一步离心沉淀也没有发现精子者为无精症患者。对精液分析为异常的患者进行Y染色体AZF微缺失基因检测；阴性对照：健康女性作为阴性对照；健康对照组：100名精子密度>20×106/mL的已婚男性（年龄20～46岁）为健康对照组。
1.2 研究方法
1.2.1 研究对象的DNA抽提：用含乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝剂的真空管抽取受试者外周血2mL并充分混匀。提取白细胞DNA的试剂盒为深圳亚能生物技术有限公司提供的全血DNA快速提取试剂盒。
1.2.2 多重聚合酶链反应（PCR）扩增检测：用深圳亚能生物技术有限公司提供的Y染色体微缺失检测试剂盒，同时检测Y染色体AZF区域内的以下15个STS序列标鉴位点（sequencetagsite，STS），包括AZFa区：SY82，SY84，SY86；AZFb区：SY124，SY127，SY143，SY134，SY128，SY133；AZFc区：SY254，SY255，SY242，SY239；AZFd区：SY152，SY145。15个序列标鉴位点分成紫、白、蓝、黄4管扩增，详细每管检测位点及排列位置见表1。每管包括14μLPCR反应液，10μL去离子水，1μL待测样本DNA，总体积共25μL。
设定的扩增程序分为3个步骤：第1个为步骤为50℃10min，95℃15min；第2个为步骤为94℃30s，58℃60s，72℃60s共34个循环；第3个步骤为72℃10min。内控对照为Y染色体性别决定区SRY基因，每次实验均以已育健康男性基因组DNA作为阳性对照，健康女性基因组DNA作为阴性对照。
1.2.3 电泳检测：吸取PCR扩增后产物6μL。点样于事先配制好的2%Biowest进口琼脂糖凝胶孔中，先用电压8V/cm，电泳4~5min使DNA迁移出上样孔，再将电压调降到5V/cm电泳30~40min，取出琼脂糖凝胶在凝胶成像系统观察电泳结果。
1.2.4 结果判读：Ⅰ管，Ⅱ管，Ⅲ管，Ⅳ管分别为健康男性的DNA提取物分别加入紫、白、蓝、黄4管，Y染色体微缺失检测正常（见图1）PCR电泳对照结果显示，检测者AZFc+AZFd区缺失，缺失位点分别是SY152、SY239、SY242、SY254、SY255（见图2）。
1.3 统计学处理
计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
Y染色体微缺失检测结果：经多重PCR扩增后电泳结果，100名健康对照组男性组未见Y染色体AZF区微缺失，健康女性对照组未见电泳区带。332例不育男性患者中共检出28例Y染色体AZF区微缺失，AZF微缺失率为8.4%。
180例少精子症患者中检出16例Y染色体AZF区微缺失，AZF微缺失率为8.9%。152例无精子症患者中检出12例Y染色体AZF区微缺失，AZF微缺失率为7.9%；无精子症患者和严重少精子症患者的Y染色体AZF区微缺失率差异无统计学意义（P>0.05）。100名已育健康男性组与不育男性组Y染色体AZF微缺失（8.4%）比较差异有统计学意义（P<0.01）。
男性不育症患者Y染色体微缺失情况：AZFb区3例，占10.7%；AZFc区15例，占53.6%；AZFa+AZFc区3例，占10.7%；AZFb+AZFc区4例，占14.3%；AZFc+AZFd区2例，占7.1%；AZFb+AZFc+AZFd区1例，占3.6%。最常见的AZF微缺失区域位于AZFc，其次是AZFb+AZFc，最后依次分别是AZFa+AZFc，AZFb，AZFc+AZFd，AZFb+AZFc+AZFd，并且，AZFc区的缺失率明显高于AZFb区（P<0.05）。
3 讨论
近年来研究表明男性不育的遗传学病因主要包括Y染色体微缺失及基因突变、单核苷酸多态性、染色体畸变等，其中以Klinefelter综合征、囊性纤维化及Y染色体微缺失最为常见，由Y染色体微缺失引起的男性患者无精子和严重少精子受到越来越多的重视。由Y染色体微缺失引起的精子生成障碍，采用药物治疗通常无效。因此对不育男性患者进行Y染色体微缺失筛查，对临床诊断不育和选择治疗方案具有重要意义。实施ICSI是目前临床对无精子症和严重少精子症男性不育者较为有效的治疗方案，有Y染色体微缺失的精子，其胚胎种植率与正常精子并无差别，但能将Y染色体微缺失基因遗传给下一代男性，引发与上一代相同的症状，为避免Y染色体微缺失基因传至下一代，可选择女性胚胎。
另外有资料显示，AZFa或AZFb完全缺失者，通过睾丸穿刺获得精子的可能性几乎为0，基本没有必要进行睾丸穿刺术获取精子，因此为了提高穿刺取精的成功率有必要在术前进行Y染色体微缺失的检测。AZFc缺失患者通过睾丸精子穿刺获得精子的概率比其他缺失类型大，同时可以从睾丸穿刺获得精子进行单精子卵泡质内注射助孕，但这些患者的后一代男性也都将是AZFc缺失的携带者，通过胚胎植入前进行Y染色体微缺失检测，选择女性胚胎可避免传到下一代。
本次研究对不育男性患者中180例重度少精子症和152例非阻塞性无精子症患者进行Y染色体微缺失进行筛查，发现有28例存在Y染色体微缺失，发生率为8.4%。包括AZFb、AZFc、AZFa+AZFc、AZFc+AZFd、AZFb+AZFc+AZFd区等多种缺失类型，在各种缺失类型中，以AZFc缺失最为常见，严重少精症和无精症患者AZF缺失的发生率相近。研究发现，Y染色体AZF微缺失对精子的生成有重要的影响，除AZFc缺失患者可能存在精子生成能力外，其他类型的缺失均发现无精子生成能力，为无精子症患者。同时AZFc缺失患者精子有进行性数量下降的趋势，部分患者最后发展为无精症，因此如果诊断为AZFc缺失的患者，应及早进行精液冻存，为以后助孕作准备。
本研究表明Y染色体微缺失是男性原发不育症的重要遗传病因。Y染色体微缺失检测对于指导临床诊断和选择治疗方案，减少遗传病的发生等都具有重要意义；故精子异常的不育患者，在确定治疗方案前，都应常规进行Y染色体微缺失检查。
