1.4 样品收集
于新疆维吾尔自治区人民医院体检中心采集样本，共收集晨起尿样 3 例，志愿者身体健康，一星期之内未服用任何药物，24 h 内未饮用含咖啡因的饮品。同时于住院部肾病科收集患者晨起尿样 1 例。尿样收集后，在 2 h 内进行处理，4 ℃下 3 000g 离心10 min,以除去固形物，上清液置于-80 ℃ 冰箱中保存，备用。
1.5 样品前处理
尿样在室温下解冻，混合均匀，取 200 μL 上清液于 1. 5 mL 具塞离心管中，加冷丙酮 800 μL,4 ℃静置 30 min,12 000g 离心 15 min 除去蛋白质，将上清液真空冷冻干燥，并用400 μL 10. 0 mmol/ L 乙酸铵水溶液（pH 3. 90）复溶作为样品溶液。用 10. 0mmol / L 乙酸铵水溶液（pH 3. 90）逐级稀释 10 倍，过 0. 45 μm 滤膜，备用。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
4 种肾脏病常用药物的分子结构式如图 1 所示。其中依那普利结构中有仲氨基、叔氨基和羧基，氨苯蝶啶中只有伯氨基和叔氨基，呋塞米中含伯氨基、仲氨基和羧基，而缬沙坦中含叔氨基和羧基，这说明 4 种药物的疏水性差异较大；同时由于均含有碱性官能团氨基，这会导致色谱峰形出现较为严重的拖尾现象。为改善峰形，提高定量准确性，参照文献[18]所建议的色谱优化过程，首先分别考察这 4 种药物在不同类型缓冲盐（pH 3. 90 的磷酸盐和乙酸铵体系）、不同乙腈体积分数（1% ~ 80%）下的等度洗脱色谱行为，以保留时间、峰形等为指标，筛选出最佳缓冲盐及其浓度和乙腈体积分数，然后再对梯度洗脱条件进一步优化，进而筛选出最佳色谱条件（见 1. 2 节）。在此优化色谱条件下，4 种药物的典型 HPLC 色谱图列于图 2.
2.2 线性范围及检出限
不同质量浓度的 4 种药物的混合标准溶液在优化后的色谱条件下进行分析（n=3），以质量浓度-峰面积平均值作图，制作定量标准曲线，以 S/ N=3 确定检出限，S/ N=10 确定定量限。由表 1 可以看出，4 种药物的线性拟合相关系数 r 均大于 0. 995,线性良好，可以用于准确定量。同时检测线性范围达到4 ~ 5 个数量级，适用浓度范围广。
2.3 回收率、精密度及尿样测定
为验证方法的可靠性，首先对 3 例健康志愿者的尿液样本采用 1. 5 节的方法进行处理，分别在上述 3 个尿样中添加 3 个浓度水平的目标物，并在优化的色谱条件下进行分离分析，所得 HPLC 典型色谱图见图 2b;对 3 个尿样中同一药物在同一加标浓度水平的数据求平均值，并计算回收率和精密度。
由表 2 可知依那普利的平均回收率为 93. 39%,氨苯蝶啶的平均回收率为 99. 20%,呋塞米的平均回收率为 89. 49%,缬沙坦的平均回收率为 98. 27%,RSD均小于 10%,表明方法的重现性良好，所建立的方法可用于实际样品中 4 种药物的分离分析。
2.4 实际患者尿样的测定
在新疆维吾尔自治区人民医院住院部肾病科随机采集晨尿样本 1 例，在优化的色谱条件下进行分析，从图 2c 中仅能观察到缬沙坦的特征峰，说明该患者仅口服过缬沙坦，该结果与临床医嘱一致。为进一步验证结果的可靠性，对该例尿样进行加标回收率测定，3 次测定的平均加标回收率为 97. 10%,RSD 为 2. 33%,表明方法的重现性良好，所建立的方法可用于实际样品中缬沙坦的分离分析。
3 结论
本文采用传统的反相高效液相色谱法实现了对尿液中 4 种疏水性差异较大，含有碱性官能团的肾脏病常用药物依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米及缬沙坦的同时分离。方法简便，可靠，为监测肾脏病患者尿液中常用药物的浓度提供了一种快速检测方法。
参考文献：
[1] Huang X Y,Zhong Y,Huang Z P,et al. Chinese Journal ofChromatography （黄小雅，钟园，黄忠平，等。 色谱），2015,33（2）：169
[2] Jin P F,Kuang Y M,Zou D,et al. Chinese PharmaceuticalJournal （金鹏飞，邝咏梅，邹定，等。 中国药学），2011,46（2）：152
[3] Peng X L,Wu P J,Zhou W L,et al. Chongqing Medicine（彭熙琳，吴品江，周唯兰，等。 重庆医学），2014,43（17）：2175
[4] Sun T,Jiang J G,Song G S,et al. China Pharmacy （孙婷，姜建国，宋更申，等。 中国药房），2014,25（32）：3053
[5] Zhang X H,Wang R,Xie H,et al. Journal of Southern Medi-cal University （张晓惠，王荣，谢华，等。 南方医科大学），2014,34（10）：1431.
