金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus） 可导致皮肤、黏膜、深部组织和重要脏器的化脓性炎症，它的致病力主要取决于产生的各种毒素和侵袭性酶。肠毒素是金黄色葡萄球菌引起食物中毒的主要原因，具有超抗原特性，能够激活大量的具有强大杀伤力的 T 淋巴细胞，使其释放细胞因子。因此一直以来是研究的重点和热点。近年来陆续发现了十几种新的肠毒素基因，但是临床株所分泌的肠毒素基因95%以上为肠毒素 A 基因（ S. aureus enterotoxingene A,sea） 、肠毒素 B 基因 （ S. aureus enterotoxingene B,seb ） 、肠毒素 C 基因 （ S. aureus enterotoxingene C,sec） 、肠毒素 D 基因 （ S. aureus enterotoxingene D,sed）[1 -3].1998 年 Maiden 等[4]在多位点酶电泳技术的基础上建立了多位点序列分型（ multi-locus sequence typing,MLST） 技术，并首次应用于脑膜炎奈瑟菌的分型研究。该技术以分析管家基因的序列多态性为基础，重复性好，试验数据全球共享，为分析金黄色葡萄球菌遗传相关性，探索菌株的起源和进化提供了巨大的信息资源。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中，在医院室内空气、各种物体表面以及医务人员手上均可检测到，对于儿童、老年人以及免疫力低下的烧伤或者透析患者具有极大的风险。在院内感染中金黄色葡萄球菌占有较大的比例，其检出率呈逐年增高态势[5].为了掌握宁波地区金黄色葡萄球菌临床株肠毒素基因分布和分子分型特点，为有效控制金黄色葡萄球菌感染提供实验室依据，特进行如下研究。
1 材料与方法
1. 1 菌株来源 2006、2008 以及 2011 2013 年收集宁波市各医院从患者标本中分离的金黄色葡萄球菌菌株。标本来自重症监护病房（ ICU） 和烧伤病房患者静脉血、气管盥洗液、深静脉导管及创口脓性分泌物。2006 年和 2008 年各收集 7 株，2011 年收集 41 株，2012 年和 2013 年各收集 50 株，共收集155 株。质控标准菌株为金黄色葡萄球菌 （ ATCC25923） ,均为本研究室保存。菌株的鉴定方法包括VITEK Ⅱ生化鉴定系统（ BioMerieux,France） .
1. 2 方法
1. 2. 1 4 种肠毒素基因和 MLST 分型扩增引物sea、seb、sec 和 sed 扩增引物见表 1,MLST 扩增和测序引物见参考文献[6].引物均由上海英骏公司合成。
1. 2. 2 金黄色葡萄球菌基因组 DNA 的提取 采用TaKaRa 公司的 MiniBEST 细菌基因组 DNA 提取试剂盒（ 3. 0 版） ,按照试剂说明书操作提取金黄色葡萄球菌基因组 DNA.
1. 2. 3 肠毒素基因扩增 采用 TaKaRa 公司 PremixTaqTM（ 2. 0 版） 试剂盒，按照试剂说明书配置 PCR反应体 系。聚 合 酶 链 反 应 （ PCR） 反 应 条 件 为94 ℃ 预变性 5 min,94 ℃ 变性 1 min,50 ℃ 退火1 min,72 ℃ 延伸 1 min,共 35 个循环，最后 72 ℃延伸10 min.取扩增产物 10 μl 点样于 1% 琼脂糖凝胶（ 内含溴化乙锭最终浓度为 0. 5 μg/ml） ,电压10 V / cm,电 泳 30 min,暗 室 内 紫 外 光 下 （ 波 长254 ~ 365 nm） 观察电泳结果，观察是否有预期分子质量大小的条带出现。
1. 2. 4 金黄色葡萄球菌 MLST 扩增、测序和数据分析 采 用 TaKaRa 公 司 Premix TaqTM（ Ex TaqTMVersion 2. 0） 试剂盒，按照试剂说明书配置 PCR 反应体系。选择 7 个管家基因 arc、aro、glp、gmk、pta、tpi 和 yqi 进行 PCR,PCR 反应条件参考文献[6 ].扩增产物利用 ABI3730 全自动基因分析仪（ 上海英骏公司） 采用测序引物对扩增的片段进行正反方向核苷酸序列测定，测序结果利用 Chromas 1. 63 软件编辑和拼接，利用 Bioedit 7. 0 软件进行校正，校正后的序 列 与 金 黄 色 葡 萄 球 菌 MLST 标 准 数 据 库（ http: / /saureus. mlst. net/） 进行比对，获得各管家基因位点的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，判断其序列型（ sequence type,ST） .利用 Mega6. 0 软件对管家基因核苷酸序列构建系统进化树，利用 eBURST V3 软件对 ST 进行分析。参考菌株来自金黄色葡萄球菌 MLST 标准数据库。
