单基因病的最新基因诊断技术概述(2)

　　3.2.1 TP-PCR技术
　　
　　TP-PCR是一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA的方法。可用于拼接融合基因；目的基因中碱基的定点突变；目的基因中某些功能结构域的人工缺失研究；在目的基因中的任何位置插入外源基因片段，进行重组基因的研究。
　　
　　该法的原理是：TP-PCR反应体系中有2种模板和3种引物，可以在同一个反应体系中产生一个重组DNA分子。设计合理的中间引物是保证TP-PCR反应成功的关键。只有中间引物设计合理才能保证2种DNA片段在融合位点正确连接。3条引物的浓度比例是另一个关键因素。要适当调节中间引物的比例使得TP-PCR反应获得最理想的结果。实验结果表明，合适的比例范围可有效增加目的片段的扩增，同时减少非特异产物的扩增，一般来说在1 / 1 000~1 / 100范围内比较合适。除此之外，为了保证PCR产物的高忠实性，需用高忠实的DNA聚合酶来代替Taq聚合酶[14-15].
　　
　　TP-PCR法 简便、快捷、经济，可以在所期望的任何位点将2种DNA片段连接起来，而无需知道DNA片 段的限制位点。通过TP-PCR进 行重组操作，可以在几个小时内于一个PCR反应体系中完成，无需高档设备仪器和试剂盒，即可实现对所研究的目的基因的改造。邓朝阳等[14]用这种方法构建融合蛋白基因---SCK基因获得成功。朱艳等[15]用该法构建抗人CD28嵌合抗体双启动子昆虫杆状病毒重组转移载体也获得圆满成功。该法的突出优点在于无需设计外源的DNA序列，即可实现对目的基因的任何常规性改造，从而避免在原有基因中引入冗余的酶切位点的碱基序列[14-16].
　　
　　3.2.2 RT-PCR,RTQ-PCR和 多重巢式RT-PCR技术
　　
　　RT-PCR为 逆 转 录PCR （reverse transcriptionPCR）的 缩写。逆转录PCR是PCR的一种衍生技术。在逆转录PCR中，一条RNA链被逆转录成为c DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA. RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量检测某种RNA的含量。
　　
　　RT-PCR有时候也会指代实时PCR （real timePCR）。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作实时荧光定量PCR （real time quantitative PCR, RTQ-PCR）[17].实时PCR,属于定量PCR的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
　　
　　多重巢式RT-PCR的原理同多重巢式PCR,不同之处在于所用的模板是c DNA而不是DNA.逆转录PCR可在RNA水平检测基因的突变类型和突变效应。实时荧光定量PCR具有灵敏、特异、技术成熟和操作简便等优点，对于临床上明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择合适治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值。在产前监测和产前基因诊断也具有重要意义。
　　
　　逆转录PCR（RT-PCR）和多重巢式RT-PCR有一个共同的缺点就是所提的RNA易降解且操作较繁琐。
　　
　　3.2.3 d PCR技术
　　
　　d PCR技 术是一种新的核酸检测和定量技术，与传统q PCR（即RTQ-PCR）技术不同，d PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比q PCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性，故得到广泛的应用。这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面都具有诸多优势，其在基因表达研究、mi-cro RNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面也具有广阔的应用前景。
　　
　　该技术是采用“分而治之”（divide and conquer）的策略，将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子（DNA模板），实现“单分子模板PCR扩增”,扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。
　　
　　d PCR是PCR领 域最激动人心的创新之一，该技术可应用于单细胞分析、罕见肿瘤等位基因检测、产前诊断以及血液中游离肿瘤DNA、表观遗传学直接相关的DNA甲基化定量检测、Ch IP定量鉴定等众多领域[18-32].如果将PCR技术进行分代的话，那么第一代PCR技术就是我们目前最常用的常规PCR了，它可通过凝胶电泳获得定性结果。而曾经风靡全球的RTQ-PCR可称为第二代PCR技术，它利用荧光试剂监控扩增，来实现相对定量，在开展基因表达分析时，需要标准曲线或参考基因来协助定量。而d PCR则可谓是第三代PCR技术，它不再依赖Cq值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，它是一种核酸分子绝对定量技术，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于一个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。它比RTQ-PCR更加灵敏、特异、精确，故日益得到广泛的应用。可应用于：癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析；病原体检测；与NGS无缝对接，对二代测序结果进行验证；mi RNA表达分析；单细胞基因表达分析；环境监测；食品检测[18-32].Floren等[28]用d PCR法成功对肉类及肉制品进行了品种鉴定和量化。日本科学家Miyake等[33]2013年对一对患有雷特氏综合症（rett syndrome, RTT）的同卵双生双胞胎进行了基因组学以及表观遗传学的研究。文章对该双胞胎姐妹（其中一个为非典型RTT,另一个为典型RTT）采用了第一代毛细管测序，二代测序、SNP和CNV芯片、基因组DNA甲基化芯片、RTQ-PCR以及d PCR等分析方法，得出结论：是表观遗传学水平上而非基因组水平上的差异，导致了两姐妹不同的临床表现。表观遗传学上的差异也许主要源自X染色体失活。在对双胞胎姐妹的CNV位点是否相同进行确认时，Miyake等首先采用CNV芯片的方法删除8 195个位点的不同；然后采用NGS进一步确认，发现其中仅有29个CNV位点可能存在差异；使用更加准确的d PCR平台后，发现在这对姐妹中没有存在CNV位点的差异，就遗传背景而言两者完全一致。在讨论部分中，作者特别指出：需要对采用芯片或NGS得到的SNP / CNV位点的相关数据采用进一步定量的分析。这篇文章正是采用了d PCR法进行验证，并进一步纠正了NGS的错误数据。
　　
　　3.3 PCR基础上的基因突变检测技术
　　
　　3.3.1扩增阻碍突变系统/限 制性核酸内切酶（am-plification refractory mutation system / restriction en-donuclease, ARMS / RE）技术
　　
　　ARMS / RE双重鉴定法特别适用于种植前基因诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）等需快速特异、准确灵敏检测的项目。此法是将ARMS[34-35]与RE巧妙结合，在设计3′端错配碱基的特异引物的同时引入酶切位点。有时一个碱基的错配不一定含有酶切位点，这时可根据限制酶的识别序列，人为设计成双错配甚至三错配。
　　
　　ARMS / RE将ARMS法和RE法合二为一，具有双重鉴定的效能，即首先用ARMS法鉴定一次，然后再用RE法鉴定一次，故可大大提高鉴定的准确率。中山大学中山医学院医学遗传学教研室曾用该法用于软骨发育不全的PGD研究并获得成功[36].但该法也有不足，其不足是往往需要花费很多时间人为错配碱基才能找到酶切位点，且所用的内切酶多数较罕见，成本较高，且酶易失活，保存期有限。