为探索一种简便有效的方法，本研究采用全骨髓贴壁法对骨髓间充质干细胞（BMSCs） 进行分离培养及初步鉴定，以使其更好地服务于临床应用。本研究通过全骨髓分离法获得大鼠BMSCs,化学药物（β-ME） 诱导 BMSCs 分化为神经元样细胞，从细胞的强增殖能力、细胞的表面标记物及分化潜能 3 方面对分离培养的细胞进行了鉴定，在长时间的未进行换液的体外细胞培养过程中发现 BMSCs 可能存在自分化现象，笔者认为，自分化对于 BMSCs 的临床治疗机制的研究极为重要。目前，国内学者对 BMSCs 的研究涉及较少。
1 材料与方法
1. 1 实验动物 清洁级 2 周龄雄性大鼠一只（体质量 75g,由桂林医学院实验动物中心提供） .
1. 2 试剂 DMEM / F12 和胎牛血清； 胰蛋白酶； 兔抗大鼠FITC-CD29、PE-CD90 单克隆抗体； 兔抗大鼠 Nse 单克隆抗体，SABC 免疫组化试剂盒（北京欣博盛生物科技有限公司） .
1. 3 BMSCs 的分离、培养及传代 大鼠断颈处死，无菌分离四肢长骨，暴露骨髓腔，用注射器吸取无血清培养液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心（800r/min × 6min） ,弃上清，用含 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，计数后以 109/ ml 密度接种于 25cm2的培养瓶，记 P0,37℃ 培养箱中培养。48h 后半量换液，以后每 3 天换液一次。至 10 ~ 13d 左右，贴壁细胞80% ~ 90% 汇合时，0. 125% 胰酶消化，约 1 ~ 2min,1 传 2,记P1,以此类推，利用 BMSCs 易消化的特点达到纯化目的，须严格控制酶的量和消化时间。每次传代用新培养瓶，以弃去贴壁非常牢固的细胞，通过多次传代对细胞进行纯化。
1. 4 形态学观察 用倒置显微镜观察并拍照
1. 5 BMSCs 细胞表型鉴定 取生长良好的 P3 代细胞，制成细胞爬片，用4%多聚甲醛固定30min ,10%BSA 封闭30min,将适度稀释的荧光标记的单克隆抗体 FITC-CD29、PE-CD90分别加入不同的切片上4℃过夜，荧光显微镜下观察荧光分布，拍照。
1. 6 BMSCs 定向诱导分化 取同一批 P3 代细胞，制成细胞爬片，适当培养待贴壁后分为对照组和诱导剂组。诱导剂组采用 1mmol/Lβ-ME 的 10% FBS 低糖 DMEM 预诱导，24h 后用含2mmol / Lβ-ME 无血清低糖 DMEM 诱导 6h,对照组中不加诱导剂，一直培养。
1. 7 神经元样细胞的免疫组化鉴定 采用 SABC 免疫组化法，用 4%多聚甲醛固定 30min,0. 1% TritonX-100 透膜 30min,3% H2O2/ 甲醇消除内源性过氧化物酶，封闭血清孵育 20min,将一抗（兔抗大鼠 Nse） 按适当比例加于玻片上，4℃湿盒内过夜，次日加生物素化二抗后 37℃下孵育 30min,加 SABC,DAB显色，苏木素复染，观察，拍照，以 PBS 代替一抗作阴性对照。
2 结 果
2. 1 倒置显微镜观察 原代分离的细胞大小均一、圆形、折光性强，悬浮，红细胞居多； 48h 后可见部分细胞贴壁，成短梭形；4 ~ 5d 开始快速增殖； 培养 8 ~ 10d 后细胞渐铺满培养瓶，成长梭形，漩涡状生长（图 A） ,此时结束原代培养，进行传代扩增，以去除结节状分布的小圆形细胞（图 B） 和长梭形的贴壁性强的成纤维样细胞（图 C） .传代培养的细胞 3 ~4h 即贴壁，细胞增殖后以梭形为主，排列有明显方向性（图 D-F） .不添加任何生长因子，细胞传 5 ~6 代左右，老化现象严重。
2. 2 BMSCs 表型鉴定 P3 代细胞免疫荧光显示 BMSC 的表面标记物 CD29、CD90阳性（图 G-H） .
2. 3 BMSCs 的神经元诱导结果 倒置显微镜观察，BMSCs 在1h 左右开始，即发生形态变化，扁平、梭形的细胞胞浆回缩，向核集中，1 ~ 3d 后出现多个延长的胞体突起，类似于神经元样细胞的假足（图 I） ; 而空白组始终未变化（图 J） .免疫细胞化学染色显示，实验组神经元样细胞的胞体及部分突起成棕黄色，Nse 阳性表达（图 K-M） ; 与诱导组同时间点的空白组几乎全为阴性（图 N） .
2. 4 未加任何诱导剂组 空白组培养 30d 左右时 BMSCs 的自分化观察，可见神经样细胞和圆形透亮的凋亡细胞。（图O-Q）。
3 讨 论
BMSCs 是骨髓中除造血干细胞以外的非造血性干细胞，正常时只有极少数在增殖期，在骨髓中的丰度很低，约占骨髓有核细胞的 0. 001% ~ 0. 01%,但取材方便，易于体外分离和扩增，具有多向分化的潜能.目前获取 BMSCs 的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞分选法、免疫磁珠法4 种.本实验通过全骨髓贴壁法，利用细胞不同的贴壁特性，随传代完成对 BMSCs 的纯化，并通过诱导证实了其分化能力，为今后进一步的研究和应用奠定了基础。
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的尚未分化的原始细胞，具有经培养不定期的分化并产生特化细胞的能力，根据来源不同可分为造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞等。间充质干细胞广泛存在于机体的多种组织（骨髓、脐带血、脂肪组织等） 中，BMSCs 是骨髓中胚层未分化的间充质干细胞，正常时只有极少数处于增殖期，在骨髓中的丰度很低，约占骨髓细胞总数的 0. 001% ~ 0. 1%,是由形态、增殖能力及分化潜能各不相同的不同亚型的异型性细胞群构成.
由于目前尚缺乏特异的干细胞标记物，也难以通过分化或增殖能力的不同，将一种亚型同另一种亚型区分开来，因此无统一的获取高纯度 BMSCs 的方法。对于 BMSCs 的体外分离培养主要有以下 4 种： 密度梯度离心法、全骨髓贴壁法、流式细胞分选法、免疫磁珠法。（1） 密度梯度离心法利用骨髓细胞成分的比重不同采用细胞分离液有效的将骨髓细胞分层且对细胞活性影响小，但缺点在于破坏 BMSCs 相应的微环境，丢失大量可能促进 BMSCs 生长的细胞因子； （2） 免疫磁珠法和流式细胞仪筛选技术法在分选过程中，对细胞的活性影响特别大，可导致提取的细胞活性丧失、增殖能力消失，而且耗费巨大，因此应用也普遍较少； （3） 全骨髓贴壁法作为一种简单、经济、高效的方法，被越来越多的应用.研究发现，BMSCs 参与构成造血干细胞的生存和分化的微环境，通过分泌细胞外基质成分对造血干细胞的分化成熟进行调控，体外培养条件下可跨胚层多向分化，具有很强的可塑性.目前大多数实验室通过 BMSCs 不表达造血干细胞标记物 CD14、CD34、CD11b和白细胞表面标记物CD45,而表达 CD29、CD44、CD71、CD90和 CD106等标记物进行初步鉴定； 阶段特异性胚胎干细胞抗原-4（SSEA-4） 和神经节苷酯（Ganglioside） 可用于准确鉴定 BMSCs,以及现在正在研制的用特异性单克隆抗体分离 BMSCs 类群。与胚胎干细胞和神经干细胞相比，BMSCs 有着难以比拟的优势: （1） 取材、移植方便、安全、损伤小、来源丰富，骨髓穿刺便可获得； （2） 短期内可大量扩增： 体外培养时，起始生长速度缓慢，约 6 ~ 7d 开始，增长速度明显加快； （3） 低免疫原型： 因细胞处于原始状态，不易被识别，所以不存在免疫排斥的特性，没有血型匹配问题； （4）具有较强的分化潜能、可塑性和跨胚层分化能力，其分化表现出明显的组织特异性，BMSCs 所到达的组织微环境决定其分化方向； （5） 归巢性： 损伤信号可以刺激干细胞向受损器官、组织迁移分化，能够归巢到受损病灶，对受损的细胞进行修复；（6） 易被外源基因转染并且能高效、稳定表达多种治疗性外源基因； （7） 能在宿主体内长期存活。
本实验采取的全骨髓贴壁法主要是通过利用 BMSCs 贴壁而造血干细胞悬浮的方法以及 BMSCs 与成纤维细胞等贴壁细胞对胰酶消化反应（包括胰酶的用量和消化时间） 的不同，利用消化的时间差，并通过传代，达到分离纯化 BMSCs 的目的，其中 BMSCs 较成纤维细胞，单核细胞更易被消化，此法操作简单，对细胞微环境和细胞活性影响都很小，使其易于保持在类似于骨髓内生长时的微环境，经过 2 ~3 次传代，便可得到相对纯化的 BMSCs.在整个机械分离大鼠骨髓的过程中，应注意严格的无菌操作，在剥离皮肤、游离四肢肌肉及分离骨髓的各个过程完成后，要注意及时更换无菌器械，不能存在侥幸心理，避免污染。另外，由于 BMSCs 生长时的密度依赖性，在传代时应注意适当的比例，以 1 传 2 为宜，在传代过程中一定要注意消化时间，以消化 1 ~ 2min,梭形细胞变圆时加含血清培养液终止消化为宜，切忌消化时间过久。实验发现尽管 BMSCs 具有向神经元样细胞分化的能力，但诱导体系和培养体系仍需改善，因为细胞培养过程中存在不同程度老化现象，表现为原本梭形的细胞呈宽大的噗状，细胞胞质内出现空泡和颗粒。诱导后形成的细胞由于一些原因尚无法在功能上进一步确定是否为神经元细胞，所以只能暂时称之为神经元样细胞。本实验最主要的意义是在一定程度上证明了 BMSCs 在无诱导条件下发生了自分化现象形成了神经元样细胞，由于对细胞自身的干预很少，使得后续研究的精确性得以保证。以往的研究和本实验均表明，在特定的诱导条件下 BMSCs 能够分化为神经元样细胞。
BMSCs 移植已开始在临床上用于治疗多种神经系统疾病，取得了相对不错的效果,但是对治疗机制尚不十分清楚，研究发现移植后的 BMSCs 分化为神经元样细胞的比例较低，认为可能是通过其分泌营养因子、生成血管、释放激素和抑制炎性反应来发挥治疗作用，而并非发生真正意义上的细胞取代.既然这样，笔者认为可以另辟思路，去繁就简，先去掉药物诱导这一环节，通过分析比较 BMSCs 的直接移植和自分化为神经样细胞后再移植治疗神经系统疾病的效果，这样可排除药物诱导对 BMSCs 的相应基因表达的干扰，使机制或通路的研究尽可能简单，以便进一步阐明，而一旦确定相应治疗机制后，再通过药物诱导，荧光定量 PCR 技术和 Western 技术分析通路中相关基因和蛋白分子水平的改变。与传统的直接药物诱导比较，这样可大大提高有效诱导药物的筛选和药物有效成分提取的效率，避免不必要的研究。为了尽可能减少诸多因 素对BMSCs的干扰，其自分化就显得至关重要。本实验在形态学上初步证明了 BMSCs 在 10% FBS 的 DMEM 培养液，5% CO2,37℃培养条件时，接种于 25cm2培养瓶中培养 30d 左右时，可见明显的神经元样细胞形态的细胞，与此同时其余的细胞均发生凋亡并逐渐消失（图 o-q） ,但是自分化后形成的神经元样细胞的数目少，单个分布，无法进行下一步的表型鉴定和相关的细胞电生理功能研究，这一缺陷应该可以通过接种75cm2培养瓶来获取相对较多数量的神经元样细胞，以进行免疫荧光和免疫组化鉴定及后续的突触和电生理功能的研究，该方面正在实验验证中。本实验在一定程度上证明了 BMSCs 确实存在自分化现象，也是本实验设计的可行性依据，而国内的文献鲜有报道 BMSCs 的自分化这一现象。
综上所述，实验通过全骨髓贴壁法，利用细胞不同的贴壁特性，随传代完成对 BMSCs 的纯化，并通过诱导证实了其分化能力，更重要的是在一定程度上证实了 BMSCs 在培养过程中的自分化，为相应的后续实验奠定了坚实的基础。
