摘 要：基因工程课程是生物工程、生物技术和生物制药等专业的必修课, 包括基因操作原理与基因工程实践两部分内容。它为分子生物学研究提供技术支持, 为工程应用提供理论指导。随着DNA合成与测序技术的发展以及新型DNA组装与编辑技术的兴起, 基因工程的概念持续升级, 基因工程的课程内容和教学方法都需要进行相应的更新与改革。
关键词：基因工程; 代谢工程; 合成生物学; 课程内容; 教学方法;
基因工程课程是生物工程、生物技术和生物制药等专业学生的骨干专业课程, 它承接上游生物化学、分子生物学等课程与下游酶工程、发酵工程等课程。基因工程课程设立的主要目的是加强对分子生物学实践环节的认识并为分子生物学研究服务, 为学生从事基因工程食品和药品的研发奠定理论基础[1]。基因工程课程和《基因工程》教材基本包括两部分, 分别是基因工程原理和基因工程应用, 不同院校的课程设置以及面向不同受用者的教材侧重点各有不同。基因工程原理以基因操作为主线, 介绍与此相关的工具酶、工具载体、PCR技术、DNA的重组、基因文库的构建与筛选、蛋白质超量表达, 以及生物大分子的各种分析和检测手段, 如DNA测序和分子杂交等。基因工程应用则可按照操作对象分为大肠杆菌基因工程、酵母基因工程、动物基因工程、植物基因工程等;或者按照服务对象分为农业基因工程, 食品基因工程和医药基因工程等[2-3]。20世纪末, 我国的高等院校和研究院所就开始在相关专业开设基因工程课程, 从而逐步建立了稳定的授课内容, 并凝练出一批优秀的教材与专注[4]。
基因工程是一门发展迅速的学科, 随着医学与生命科学领域的一些理论突破与技术更新, 基因工程的策略与技术手段也在不停发展。教育部的生物工程专业本科教学质量国家标准中基因工程课程为32学时, 武汉大学生物制药专业本科教学质量标准中基因工程课程为36学时。在有限的学时内, 既要传授经典的课程内容, 又要把握学科的进展, 这需要我们对基因工程课程的授课内容及时更新、对课程重点和授课方式进行相应的改革。笔者曾在国家理科基础科学研究和教学人才培养基地生物学专业学习, 参与了《基因工程》第一版的统稿工作和第二版的编写工作[5], 近年来一直讲授生物制药专业的基因工程课程。现根据本人的理解对基因工程课程授课内容与授课方法亟待更新与改革之处进行总结, 仅供同行参考。
1、DNA合成与测序技术的发展改变基因工程课程的授课重点
随着DNA合成成本的降低, 以往一些经典的基因扩增、改造和重组技术, 重要性变得越来越低。比如通过RT-PCR扩增c DNA, 或者通过构建文库获取c DNA, 以及通过重叠延伸PCR将外显子融合起来得到c DNA, 现在都可以通过DNA合成的手段来实现相同的目标。PCR介导的定点诱变, 与直接合成基因相比, 也并不是一定就有时间和成本的优势。如果需要对一个基因内部多个不同的位点进行改变, 直接合成基因比定点诱变反倒更有优势。对于一些需要通过多步克隆操作才可以得到的重组DNA片段, 如果其碱基对不是特别多, 直接合成DNA片段会更加便捷。DNA合成技术的快速发展, 使得以往必须通过复杂的基因操作才能获得的目标DNA, 只需要完成精确的设计就可以一步实现从无到有。这些对应的操作技术与原理, 不应该一直作为教学的重点。基因操作的某些经典技术曾经创造了辉煌, 但是逐渐退出历史舞台也是一种必然的趋势。
DNA测序成本的降低以及高通量测序技术和单分子测序技术的兴起, 使得基因操作变得过程更加可控、结果更加准确。DNA测序与分析, 可以很大程度的代替传统的Southern杂交, PCR筛选等DNA水平的检测。RNA测序, 也可以补充或替代Western杂交, 实时定量PCR以及芯片杂交等转录水平的检测。劳动强度大、经验依赖性强的分子杂交很多时候可以通过测序解决。传统的Sanger测序法 (双脱氧链终止法) 进行基因组测序, 需要有大片段文库辅助填补缺口。构建大片段文库, 建立重叠联合群, 进行染色体步查等操作, 既费人力也费经费。高通量测序技术可以降低每个碱基对的测序成本, 单分子测序技术可以使每个测序反应获得10~100 kb的读长[6], 这从根本上改变了人们开展测序工作时的策略选择。因此, 在基因工程课程教学的过程中, 测序原理的讲述固然重要, 但是让学生思考什么时候可以通过测序解决问题, 如何制定合理的测序策略更好的解决问题, 在今后的基因工程课程教学中显得更加重要。
2、新的DNA组装与编辑技术的出现促进基因工程授课方法的反思
无论是基因工程课程还是《基因工程》教材, 基因工程工具酶和工具载体的介绍一般位于开篇部分, 并且占据较大的篇幅。学生刚开始进行基因工程的学习, 对课程宏观了解还不够, 对开展基因工程研究和实践所需的思维习惯还没有养成。这部分内容知识点丰富, 各知识点之间的联系紧密程度不高。突然面对如此零碎密集的知识点, 学生非常容易产生厌倦情绪。如果不能很好地掌握这部分知识, 就不能胜任复杂的多步骤重组克隆工作。以往课程学习结束以后, 部分学生只会进行简单的酶切连接转化操作, 但是不会进行策略选择和方案制定, 知其然不知其所以然。
DNA同源片段融合介导的克隆, 可以极大地方便DNA片段的体外组装。此方法不受酶切位点的限制, 只需要两个DNA片段之间具有15 bp的末端同源序列, 就可以实现体外融合, 并且可以实现多个DNA片段之间的融合。代表性的工具有吉布森组装克隆试剂盒, DNA的融合包括外切、聚合和连接3个步骤[7]。之后发展起来的工具, 如Easy Fusion、Fast Fusion以及In Fusion等试剂盒, DNA的融合通过重组酶催化, 过程更加简洁。新兴的DNA组装技术正在并且将更大程度的替代传统的DNA酶切酶连重组, 这使复杂的多步骤重组克隆工作变得简单易行。基因工程课程的内容保持及时更新, 通过传授新的知识和技术可以将学生从复杂、琐碎的旧知识中解放出来。
CRISPR Cas9 (规律成簇间隔短回文重复) 系统是新近从细菌中发现, 随即被开发成可用于多种细胞的基因组DNA编辑的工具[8-9]。经典的基因工程实践中, 获取基因组大片段DNA是借助高容量的载体构建基因组文库, 然后从文库中筛选目标片段。有了CRISPR Cas9 DNA切割工具, 配合上述DNA同源重组克隆技术, 我们可以直接从基因组DNA中定点抓取目标DNA片段, 不再需要构建文库、筛选文库, 省时省力。此外, CRISPR Cas9系统还可以用于基因组的编辑, 定点进行基因的敲出 (knock out) 或敲入 (knock in) 。这意味着科学家可以借此技术编辑人类自身的基因组, 意义非凡。所以, 在基因工程课程的教学过程中, 一定要避免给学生灌输陈旧琐碎的基因操作技术与原理, 应该鼓励学生接触本学科最前沿的知识和技术, 引导学生探讨和展望新生事物。
3、基因工程课程的教与学都要带有发展的眼光
基因工程兴起的早期时候, 主要是针对单个基因进行操作, 代表性的成功范例有基因工程重组人胰岛素和转基因抗虫稻。前者是将人胰岛素编码基因转到大肠杆菌中超量表达, 后者是将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因转到水稻中让其在叶片中特异性表达。单个目的基因的增加创造的基因工程产品或者基因工程体, 带来了巨大的使用价值, 极大地改善了人类的生产方式和生活质量。人类的需求是不断增加的, 科学技术也是不断进步的, 基因工程的概念和内涵也在不停地发展。在现在的《基因工程》或《基因工程原理》等教科书中, 出现了第二代基因工程的提法, 系指蛋白质工程。第三代基因工程, 则是指途径工程, 或者更准确的可称其为代谢工程[2,10]。从广义上讲, 甚至可以称合成生物学为第四代基因工程。
我们以重组酵母菌发酵生产青蒿素的前体物青蒿酸为例, 介绍各个基因工程衍生概念之间的关系。已知在植物细胞中以异戊烯基焦磷酸为底物合成青蒿酸需要三个基因, 法呢基焦磷酸合成酶 (催化异戊烯基焦磷酸合成法呢基焦磷酸) 编码基因ERG20、青蒿二烯合成酶 (催化法呢基焦磷酸合成青蒿二烯Amorpha-4, 11-diene) 编码基因ADS和细胞色素P450单加氧酶 (催化青蒿二烯氧化形成青蒿酸) 编码基因CYP71AV1[11]。首先通过基因操作, 增强酵母细胞3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (合成异戊烯基焦磷酸的关键酶之一) 编码基因t HMGR的表达以提高异戊烯基焦磷酸的合成效率, 减弱角鲨烯合成酶 (以法呢基焦磷酸为底物合成固醇的第一个酶) 编码基因ERG9的表达以减少法呢基焦磷酸向其他合成途径的流量[11]。这一系列的基因工程改造可称之为代谢工程, 其目的就是构建一个可以大量供给异戊烯基焦磷酸的底盘细胞。然后依据植物来源的3个必须酶的蛋白质序列合成基因, 构建一条可以在酵母细胞中表达的青蒿酸合成途径。将此外源途径植入底盘细胞, 测试重组细胞的代谢流, 调校外源元件与底盘细胞之间的适配性, 得到一个高效合成青蒿酸的细胞工厂。这整个过程可称之为合成生物学。
通过概念的比较和具体案例的分析可以发现, 基因工程经历了从单个基因操作到多个基因操作、从简单性状的改良到复杂性状的改良、从改造物种到创造物种的发展。每一次基因工程概念的升级就意味着一次基因工程技术的质的飞跃, 基因工程学科的发展必然导致基因工程课程内容的更新和课程重点的转移。扎实贯通经典的基因工程原理, 时刻关注新兴的基因工程技术, 放眼展望基因工程的衍生学科, 教师才能将基因工程课程教好, 学生才能将基因工程课程学好。
综上所述, 本文从DNA合成、测序、组装与编辑等技术入手, 结合基因工程与代谢工程和合成生物学等衍生学科的内在关系, 阐述了基因工程的学科发展以及学科发展带来的课程内容的更新。基因工程课程的知识更新速度快, 经典原理要传承, 新兴技术要传授, 这需要我们重新思考基因工程课的教学方法。故步自封守着经典不前进不行, 一味追求新技术亦步亦趋也不是好主意。我们应该引导学生学习基因工程昨日的经典、掌握基因工程今天的现状, 更应该鼓励学生创想基因工程明天的前景、创造“第五代”基因工程。
参考文献
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