摘 要： 本文探究了环磷酰胺对雄性小鼠睾丸标志酶、精子质量等关于生殖毒性的影响。结果显示, 环磷酰胺组小鼠体重显着降低, 但是睾丸指数和附睾指数不变;精子的畸形率显着上升而精子密度和活力不变;睾丸标志酶:实验组乳酸脱氢酶与对照组比显着降低, 但是γ-谷氨酰转肽酶却显着升高了。总地来说, 环磷酰胺对精子的质量有明显的毒副作用, 对生殖系统有不利影响。
关键词： 环磷酰胺; 精子质量; 睾丸标志酶;
Abstract： This study investigated the effects of cyclophosphamide (CP) on testicular enzyme and sperm quality in male mice. Results showed that as compared with the control, the weight of mice in the CP group was significantly reduced but the testis index and epididymis index were unchanged; the sperm abnormality rate significantly increased while the sperm density and viability kept stable; Testis marker enzyme: lactate dehydrogenase in CP group decreased but γ-glutamyltransferase (γ-GT) increased when compared with the control. In conclusion, CP has significant toxicological effects on the quality of sperm and has adverse effects on the reproductive system.
Keyword： cyclophosphamide; sperm quality; testis marker enzyme;
环磷酰胺 (cyclophosphamide, CP) 是一种常用抗肿瘤药, 用于肺癌、结肠癌等疾病的治疗。一般来讲CP会特异性靶向癌细胞, 但对正常细胞也有毒害作用, 如白细胞减少, 脱发等, 而且对生殖系统的影响特别大。睾丸生精上皮细胞分裂频率高, 对化学治疗药物高度敏感[1]。临床观察发现, CP的使用可致男性性腺功能减退, 睾丸萎缩精子数量变少[2]。动物学实验也表明, 连续注射CP可导致体重、睾丸和附睾重量显着减轻, 精子畸形率显着升高[3-4]。尽管已有很多文献报道CP对于哺乳动物精子质量的影响, 但没有专门对睾丸标志酶影响的报道。将精子质量与睾丸标志酶活性进行结合分析, 对于确定CP的生殖系统毒性及可能的作用机制具有重要意义。本文以昆明小鼠作为实验对象, 研究腹腔注射CP对小鼠睾丸发育、睾丸标志酶活性以及精子质量的影响。
1、 材料与方法
1.1、 实验动物
昆明雄性小鼠均重25.29±1.14g, CL级别购自金华防疫中心。
1.2、 分组及实验方法
小鼠在动物房中适应1周后进行实验。20只小鼠随机分为两组, 每组10只, 记录初始体重。实验组小鼠腹腔注射CP (40mg-1kg-1d-1) , 对照组小鼠腹腔注射等量灭菌生理盐水。连续7天染毒后停止注射并进行常规饲养。35天后禁食不禁水24小时, 记录体重。随后处死小鼠取出睾丸和附睾, 睾丸指数= (睾丸质量/体重) *100%、附睾指数= (附睾质量/体重) *100%。将取出的睾丸装在1.5m L离心管中, 置于-20℃冰箱保存, 待用。
1.2.1、 精子收集
将附睾迅速置于2ml生理盐水的洁净血清瓶中, 用探针将附睾剥离置于37.0℃恒温箱中孵育10min, 使精子游出, 过200目不锈钢滤网后所得的精液分为三份, 分别用于测精子活力、密度和精子的畸形率。
1.2.2、 精子检测
畸形率检测将精子悬液进行涂片, 用2%伊红染色30min, 晾干用甲醇固定2 min, 用蒸馏水冲洗晾干后置于显微镜下, 记录畸形数目比如胖头、双尾双头、缺尾有卷尾、香蕉头、无钩状等, 并计算畸形率, 畸形率=畸形数/1000*100%。、
表1 环磷酰胺对小鼠体重、睾丸、附睾重量的影响 (*与对照比:p0.05)、
表2 环磷酰胺对小鼠精子畸形率、活力、密度的影响
图1 CP对小鼠睾丸标志酶LDH、γ-GT的影响、
活力检测取适量精液于载玻片上, 在显微镜下观察并记录直线运动、旋转运动、振摆运动的精子数, 精子活力=直线运动数/ (直线运动数+旋转运动数+振摆运动数) *100%。
密度检测取精液用血细胞计数板计数, 计算精子密度。
1.2.3、 睾丸酶活性测定
按南京建成生物有限公司提供的试剂盒说明书进行乳酸脱氢酶 (LDH) 和γ-谷氨酰转肽酶 (γ-GT) 的测定。
2、 结果与分析
2.1、 小鼠一般情况
与对照组相比, CP组的小鼠体重显着降低 (p<0.05) , 睾丸指数和附睾指数则没有明显变化 (p>0.05) , 具体见表1。
2.2、 小鼠精子活力、密度以及畸形率
与对照组相比 (表2) , 实验组小鼠精子的畸形率显着上升 (p<0.01) , 而精子活力和密度则显示降低趋势, 但无统计学意义 (p>0.05) 。
2.3、 小鼠睾丸标志酶的活力
由图1可知, CP组γ-GT较对照组有显着上升 (p<0.05) , 同时LDH较对照组显着下降 (p<0.05) 。
3、 讨论
睾丸是产生精子和分泌雄激素的器官, 附睾则是精子发育、成熟的“摇篮”, 具有吸收分泌和浓缩功能[5]。通过实验可以看到, CP处理组体重明显降低, 但睾丸指数与附睾指数未见显着差异, 说明在CP影响下, 睾丸和附睾的重量减轻程度与体重减轻程度相同, 因此其脏器系数维持不变。
LDH是参与糖酵解和糖异生中催化乳酸和丙酮酸之间氧化还原反应的酶, 主要位于生精小管内参与能量代谢及生精上皮成熟, 是支持细胞、睾丸间质细胞及生精细胞成熟的标志酶之一。其活力的改变 (增加或降低) 会导致睾酮分泌减少, 精细胞生长因子减少使精子发生及发育受阻[6]。在本实验中LDH活性显着下降, 提示CP具有损害曲精管内精子的产生、发育、成熟的潜在危害。
γ-GT也是重要的睾丸标志酶, 具有为发育中的精子提供营养和保护, 调节生精细胞周期的作用[7]。在本研究中, CP处理组的γ-GT活性显着升高, 这与文献报道的毒物刺激下睾丸γ-GT活性显着下降不同, 说明在本实验浓度下, 小鼠可能可以通过代偿性增加γ-GT的活性来缓解CP对睾丸 (包括精子) 的毒害作用。
结合小鼠精子密度、精子活力和LDH、γ-GT酶活性不难看出, CP虽然降低了LDH酶活性, 具有影响精子发生、发育、成熟的潜在危害, 但同时CP也提高了γ-GT酶活性, 这可能在一定程度上缓解了LDH酶降低带来的损伤, 因此, 最终在综合作用下, 精子密度和精子活力维持不变。除了密度和活力, 形态也是精子质量的一个重要标志。在本研究中, 实验组的精子畸形率显着高于对照组, 其中的原因可能就与CP的基因毒性有关[8]。
参考文献：
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