摘 要： 目的 制备载10-羟基喜树碱 (HCPT) 的乳酸/羟基乙酸共聚物 (PLGA) 微球, 模拟体内环境进行药物的缓释研究, HCPT微球制剂用于肝癌治疗。方法 采用复乳溶剂蒸发法分别制备载HCPT以及空载的PLGA微球, 体外释放, 兔VX2肝癌造模, HE染色分析治疗效果。结果 载HCPT的PLGA微球, 电镜表征稳定, 体外释放良好, HE染色分析肝癌治疗较好。结论 载HCPT的PLGA微球治疗肝癌效果良好。
关键词： 10-羟基喜树碱 (HCPT) ; 乳酸/羟基乙酸共聚物 (PLGA) ; VX2细胞; HE染色;
Abstract： Objective To prepare polylactic-co-glyconlic acid (PLGA) microspheres containing 10-hydroxycamptothecin (HCPT) were prepared, and to simulate the drug release in vivo.HCPT microspheres were used in the treatment of liver cancer.Methods HCPT loaded microspheres and PLGA microspheres were prepared by double emulsion solvent evaporation method, and then released in vitro.The therapeutic effect was analyzed by HE staining for rabbit VX2 liver cancer model.Results HCPT PLGA microspheres were stable and were well treated by HE staining in vitro.Conclusion PLGA microspheres loaded with HCPT have good therapeutic effect on liver cancer.
Keyword： HCPT; PLGA; VX2; HE staining;
10-羟基喜树碱 (HCPT) 是一种活性生物碱[1,2,3]。通常作用于细胞周期S期, 为细胞周期特异性药物, 在较高质量浓度时对核分裂有抑制作用[4,5]。10-羟基喜树碱难溶于水, 微溶于多数有机溶剂, 半衰期短, 目前临床上使用的多为钠盐注射液、粉针剂及胶囊剂[6]。
乳酸/羟基乙酸共聚物 (polylactic-co-glyconlic acid, PLGA) 是由乳酸和羟基乙酸缩合而成, 可经人体正常代谢, 最终降解为H2O和CO2[7,8,9]。PLGA具有良好的生物相容性和可降解性, 被广泛地应用于药物载体研究, 因此本研究探索了PLGA微球的制备方法, 并将HCPT成功包埋于PLGA微球, 通过模拟体内环境释放HCPT, 探索载HCPT的PLGA微球在释放HCPT时的释放情况等, 为载HCPT的PLGA微球体内试验提供理论依据。
1、 仪器与试药
1.1、 仪器
FD-1A-50冷冻干燥机 (上海比朗仪器有限公司) ;RE-501旋转蒸发仪 (山东博科科学仪器有限公司) ;S10匀浆机 (新芝生物科技有限公司) ;HH-2恒温水浴锅 (郑州宏朗仪器设备有限公司) ;SF-477S药品冷藏柜 (欧宝科技有限公司) ;THZ-98温控摇床 (太仓摇床仪器有限公司) ;UV-1600PC紫外可见分光光度计 (上海美谱达科技有限公司) ;zs90激光粒度仪 (英国马尔文科技有限公司) 。
1.2、 试药
PLGA (批号P133293) 和聚乙烯醇 (PVA, 批号P105126) 均为上海阿拉丁生化科技股份有限公司) ;10-羟基喜树碱 (批号SH8220) 和PBS (规格:500mL) 均为北京索莱宝科技有限公司;二氯甲烷 (分析纯, 规格:500 mL, 西陇化工股份有限公司) ;DMEM高糖培养基 (批号1861453, Bibco公司) 。
2、 方法与结果
2.1、 载HCPT的PLGA微球制备
采用复乳溶剂蒸发法, 将200mg PLGA溶解在10mL二氯甲烷溶液中, 将10mg HCPT加入到上述溶液中, 用手持式匀浆机以5 000r·min-1高速搅拌10s, 形成初乳溶液;迅速将初乳溶液倒入10mL 30g·L-1的PVA中, 冰浴下以1 000r·min-1搅拌10s, 形成复乳溶液;将复乳溶液倒入500mL 5g·L-1的PVA中, 室温下磁力搅拌2h, 减压蒸馏6h去除其中残余的有机溶剂, 以5 000r·min-1离心15min, 去离子水洗3次, 将沉淀冷冻干燥可得到PLGA微球载HCPT粉末, 于4℃保存备用。
利用同样的方法制备不加药物的空白的PLGA微球粉末。
2.2、 PLGA微球粒径测定
称取一定量载HCPT的PLGA微球与空白PLGA微球各自溶于含5g·L-1吐温80 (Tween 80) 的水中使得质量浓度为1mg·mL-1, 超声分散10min后立即用激光粒度仪测定粒径。同一个样品测定3次, 取平均数。
2.3、 载HCPT的PLGA微球体外释放
取制备好的载HCPT的PLGA微球溶于含0.5%Tween 80的PBS缓冲液中混匀溶解, 并用锡箔纸避光。37℃条件下以200r·min-1振荡培养, 每隔24h取样, 以3 000r·min-1离心5min, 取上清液, 于4℃保存, 并补充3mL PBS缓冲液继续恒温振荡培养, 连续18d取样。取样完成后, 利用紫外分光光度计测定HCPT的浓度, 绘制标准曲线, 根据标准曲线确定释放量, 绘制释放曲线。
2.4、 载HCPT的PLGA微球载药量包封率测定
根据体外释放数据, 完全释放的10-羟基喜树碱的量作为PLGA微球包埋HCPT的最终量, 包埋率为装载HCPT的质量除以使用PLGA的量, 包封率为实际包埋的HCPT的量除以初始使用的HCPT的量。
2.5、兔肝癌模型造模VX2细胞培养
从液氮中取出冻存管, 用PE手套色裹, 用镊子迅速将其置于38～40℃温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1min内融化, 打开冻存管, 迅速将细胞悬液吸到已经装有10mL特定培养基的离心管中, 混匀, 将细胞移至培养瓶中, 37℃培养, 第2天观察生长情况, 换培养基, 继续培养。弃去培养上清液, 用PBS缓冲液洗2遍, 0.25%胰酶 (含0.02%EDTA) 消化3min, 加入DMEM高糖培养基终止消化并悬起细胞;收集细胞至离心管中, 以1 000r·min-1离心3min, 弃尽上清液, 加入DMEM高糖培养基吸管吹匀;将上述细胞悬液稀释至适宜细胞密度后加入准备好的培养皿中, 在37℃体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养。
肿瘤细胞接种:收集生长状态良好的VX2细胞, 消化悬浮后接种在新西兰兔右侧后腿, 1～2周后基本形成肿瘤, 之后进行肝癌模型造模。
兔肝癌模型建立:将成瘤后新西兰兔的肿瘤取下, 裁剪成2～3mm3大小瘤粒。麻醉移植兔子, 剑突下约2cm开口, 将肝脏暴露在视野下, 用显微镊子夹起瘤块, 包埋在肝脏中, 深约1cm, 待肝脏无瘤粒溜出、无出血, 关闭腹腔, 缝合。
2.6、 HE染色
将实验动物分为对照组 (生理盐水假栓塞) 、空白微球组 (使用空白微球栓塞) 、碘油组 (使用超液化碘油栓塞) 和HCPT微球组4个组分, 每组6只新西兰兔。取样固定切片后, 取出组织用流水冲洗数小时去除固定液福尔马林, 将组织经体积分数为70%, 80%和90%各级乙醇脱水、无水乙醇、二甲苯等量混合液浸泡15min, 用二甲苯浸泡至透明为止。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min, 再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50～60min。石蜡包埋, 切片。将石蜡切片进行烤片, 然后脱蜡, 水化。将浸入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3min, 盐酸乙醇分化液分化15s, 稍水洗, 返蓝液返蓝15s, 用流水冲洗, 伊红染色3min, 用流水冲洗, 脱水, 透明, 中性树脂封片, 镜检。
2.7、 实验结果
2.7.1、 载HCPT的PLGA微球制备
见图1。载HCPT的PLGA微球以及空载的PLGA微球扫描电镜图片均为圆球状, 大小均匀, 形状规则稳定, 载HCPT的PLGA微球表面更为粗糙, 宏观上呈淡黄色粉末, 空载的PLGA微球为白色粉末。通过扫描电镜微观比较空载和载HCPT的PLGA微球表面形貌, 实验过程中包埋HCPT并没有影响到微球的稳定性和成球性, 与空载的PLGA微球无区别。
图1 PLGA微球扫描电镜
Fig.1 Characterization of PLGA microspheres by scanning electron microscope
2.7.2、 载HCPT的PLGA微球粒径测定
见图2。比较2种微球的粒径, 可以观察到粒经差距不大, 主要分布在20～30μm间, 与扫描电镜的比较结果一致, 说明PLGA微球包埋HCPT后不影响粒径及稳定性, 显示了PLGA微球良好的药物包埋性能。
2.7.3、 载HCPT的PLGA微球体外释放
配制一系列质量浓度的10-羟基喜树碱, 溶于含0.5%Tween 80的水中, 使得质量浓度分别为1, 2, 5, 8和10μg·mL-1, 在383nm处测定其紫外吸光度值A值, 根据所测得的A值制作释放函数:y=0.021 3x+0.006 4 (R2=0.992 8) ;可知在0～10μg·mL-1质量浓度内线性关系良好。利用此标准曲线计算10-羟基喜树碱的累积释放量。
图2 PLGA微球粒径
Fig.2Size distribution of PLGA microspheres
载HCPT的PLGA微球载15d趋近于释放完全, 全程的释放曲线呈S型, PLGA 100mg最终累积释放的HCPT为4.56mg, 故包埋率为4.56%, 初始投入HCPT 5mg, 因此包封率为91.2%。连续19d不间断取样, 测定HCPT的累积释放率, 第1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17和19天的累积释放率分别为2%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 41%, 55%, 72%, 82%和95%, 释放曲线见图3。
图3 载HCPT的PLGA微球体外释放曲线
Fig.3 The release curve of HCPT PLGA microspheres in vitro
2.7.4、 HE染色分析
对照组假栓塞与空白微球组肝癌细胞生长致密, 呈卵圆形, 未见细胞坏死和凋零改变, 碘油组和HCPT微球组可见大面积的细胞坏死和凋亡改变, 且HCPT微球组更为明显。见图4。
图4 HE染色分析
Fig.4The analysis of HE staining
3 讨论
10-羟基喜树碱良好的抗癌效果受到人们的关注。基于10-羟基喜树碱水溶性差、结构不稳定和见光易分解的缺点, 本实验采用PLGA微球作为药物载体进行包埋HCPT, 从而解决在给药过程中半衰期短、毒性强及易分解的问题[10,11,12,13]。
本实验通过优化工艺改善制备条件, 采用复乳溶剂蒸发法制备了均一稳定的PLGA微球, 并通过在制备微球过程中加入HCPT, 实现了包埋HCPT PLGA微球的制备;扫描电镜分析载HCPT的PL-GA微球与空载PLGA微球相比, 差别不大, 只是载HCPT的PLGA微球表面略微粗糙, 宏观观察呈淡黄色粉末 (空载PLGA呈白色粉末状) , 表明HCPT已被包埋进去。激光粒度仪对空载和载HCPT的PLGA微球进行表征, 粒径大部分集中在20～30μm间, 并没有因为包埋疏水的HCPT而改变, 说明了PLGA具有良好的药物包埋能力和稳定的结构。
进一步模拟体内环境的HCPT药物缓释, 在避光条件下, 于37℃以200r·min-1振荡培养, 每天定时取样, 连续18d不间断, 单独对HCPT对照品进行紫外一定质量浓度的标准曲线测定, 根据标准曲线算出累积释放量, 绘制释放曲线, 表明载HCPT的PLGA微球在15d趋近于释放完全, 全程的释放曲线呈S型, 5～10d释放速率急剧增大, 10～15d释放趋缓直至全部释放。相比于游离的药物, 微球载药的控制释放极大地提高了HCPT的利用率, 也减少了它的毒性和不良反应, 显示了一定的应用价值和使用前景[14,15,16]。
HCPT微球制剂用于兔VX2肝癌治疗, HE染色分析对比对照组和碘油组发现, HCPT微球制剂可大面积地使肝癌细胞坏死和凋亡, 表明其具有治疗肝癌的疗效。因为这些抗癌药物制备成载体制剂注入体内后可明显增大抗癌药物在肝、脾、肺及淋巴等部位的质量浓度, 从而提高疗效[17,18,19]。
虽然10-羟基喜树碱新剂型仍然处于实验阶段, 研究者通过各种方法改进HCPT的给药方式[20], 本研究提供的载HCPT的PLGA微球在体外环境下显示了良好的药物缓释性能, 为接下来的体内给药实验提供了参考和依据。
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