基因修饰是一种通过同源重组直接改变基因信息的一种技术。TALEN 和 ZNF 打开了基因编辑的大门，通过修饰动物的某些功能基因，为产生转基因模型、为基因功能的研究做出了巨大的贡献[1].虽然TALEN 和 ZFN 已经成功的达到了基因修饰的目的，但是仍然有不尽人意之处。ZFN 被认为是最有潜力的基因改造技术，但对于每一种打靶的基因，都需要构建庞大的锌指文库，筛选出特异的锌指蛋白，这种方法工作量大，花费昂贵，并且有一定的毒性。相比之下，尽管 TALEN 有其优势，但也有一个问题，需要复杂的构建质粒和有脱靶的问题。为了解决这一问题，人们发现了更加精确的、更加经济、可操作性高的基因打靶技术-CRISPR/Cas9 技术。成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats,CRISPRs）是存在于细菌和古生菌中的获得性免疫系统。CRISPR/Cas9 技术是一种新型的基因打靶技术，修饰某一功能基因需要精确的基因编辑技术，CRISPR/Cas9 技术是一种由RNA 介导的 DNA 点突变的获得性免疫系统[2].
1 CRISPR/Cas9 系统的简介
CRISPR 序列首次引起人们注意是在 1987 年，是在 Escherichia coli 基因组中发现的[3],所有细菌基因组的 40%都存在该序列。CRISPR/Cas9 是细菌和古生菌抵御外来侵略的一种重要手段，利用这一特点，将它对外源基因进行修饰。CRISPR 系统主要有三类，I 类主要是通过 Cas 3 发挥作用。Ⅱ类的通过 Cas9 行使剪切作用，它的工作原理就比Ⅰ类、Ⅲ类CRISPR 系统简单的多，所以研究的更为广泛，只需要一种蛋白就可以，并且利用小 RNA 干扰将外源DNA 沉默[4].Ⅲ类主要是通过 cas 10 发挥作用功能。
CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列（re-peats）组成，首先是一系列 Cas 蛋白，有 Cas 9、Cas1、Cas 2、Cas 2.其次是一些重复序列，重复序列的长度通常为 21~47 bp.重复序列之间被 26~72 bp 间隔序列（spacer）隔开。CRISPR 就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。Ⅱ类 CRISPR/Cas 9 系统发挥作用时仅需要三种组分：cas 9 蛋白、两个非编码RNA:有打靶位点的 crRNA 和反式激活 crRNA（tracrRNA）。Cas 9 蛋白是一种具有剪切功能的核酸酶，编码 1 367 个氨基酸，有 1 个 HNH 核酸酶结构域和 3 个 RuvCI 结构域[5],可以对打靶位点进行剪切。crRNA 和 tracrRNA 形成一种复合物，称为 gR-NA,由 crRNA 与打靶位点进行碱基互补配对，指导cas 9 蛋白对打靶位点进行剪切。Cas 9 蛋白的 HNH核酸酶结构域剪切互补链，而 Cas 9 RuvCI 结构域剪切非互补链。细胞会通过自身 DNA 同源重组或者非同源末端连接机制修复断裂的双链，在修复过程中会出现高几率的基因缺失、插入和改变（图 1）。达到基因修饰的目的。打靶位点的 3′ 端有一个 PAM 序列，称为前间区序列邻近基序（protospacer adjacentmotifs,PAM），碱基序列为 NGG[6].正是由于此识别位点的存在，使 Cas 9 蛋白在剪切的时候，能够识别与crRNA 互补的位点，由于 gRNA 不存在 PAM,所以也就避免了 Cas 9 将 gRNA 进行剪切[7].在人类基因组中，平均每 8 bp 就出现一个 NGG 的 PAM 结构，这也就使得 CRISPR/Cas 9 技术可以更彻底的为人类服务。对 gRNA 的结构进行分析（图 1），经大量实验证明，67~85 bp 的 tracrRNA 有较高的打靶效率[10].肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）又名 GDF-8（转化生长因子）是 1997 年发现的骨骼肌生长发育负调控因子[8].研究证实人的 MSTN 由 3 个外显子和 2 个内含子组成，在骨骼肌中特异性表达。Myostatin 突变或缺失均可以导致肌肉质量的显着增加。带有遗传突变的 Myostatin 基因，导致该基因功能失活，产生肌肉急剧增加的双肌表型，从而证明了 Myostatin 基因是骨骼肌特异性生长发育的负调控因子。
2 材料与方法
2.1 材料
根据网址 ,选择兔子（Oryc-tolagus cuniculus ）为物种进行设计打靶位点。筛选的打靶位点为 GCCATGGTAGTAGACCGCTGTGG,PAM结构为 TGG.兔成纤维细胞由中国农业大学惠赠；Cas9 与 gRNA 由金唯智公司合成；基因组提取试剂盒（Tissue DNA Kit 货号：D3396-01）购自于 OMEGA公司；dream taq 购自于 fermantas 公司；T7 Endonu-clease1 购自于 NEB 公司。
