蛙类可以控制昆虫的数量,同时也是许多食肉动物的食物来源,在食与被食的食物链中,蛙类在生态系统中扮演着重要的角色[1].近年来蛙类种群数量趋于下降[2-4],环境化学污染( 如杀虫剂、重金属、氯化物) 对蛙类的影响备受关注[5,6].蛙类作为环境监测指示生物被广泛应用在科学实验中[7].
蛙的一生要经历受精卵、蝌蚪和成蛙 3 个阶段,受精卵和蝌蚪历时较短,成蛙是蛙类变态后的主要生命形态,担负着交配繁殖的重要任务.因此、研究环境污染物对成蛙的毒性影响尤为重要.但目前研究农药、重金属等环境污染物对蛙类的毒性及安全性评价主要集中在受精卵、蝌蚪[8-10]和蛙类的一些离体组织上[11],或者对幼蛙进行野外实验时采用环境给药[12].由于蛙类的独特生物学特性---对活动的物体较敏感,其染毒方式的选择比较困难,因此,对于成蛙消化道染毒的研究报道较少.
在开展实验动物毒性实验时,实验动物的染毒方式一般选择经口染毒( 通过胃肠道) 、注射染毒和皮肤染毒等,由于不同的染毒方式可能导致动物的不同剂量效应反应[13],为了能够精确给药,我们拟以虎纹蛙成蛙为实验动物,采用人工灌胃方式进行给药,以探索一种新的成蛙给药方式,为以成蛙为受试动物进行药物毒性研究提供新的途径和方法.
1 材料和方法
1. 1 成蛙的保定
在抓握蛙的时候应佩戴表面光滑的乳胶手套.手掌抓住其背部,腹部朝下,放在湿纱布上,防止擦伤成蛙的皮肤,拇指和食指卡住其头部两侧,另一只手,遮住成蛙的眼睛,使其平静,待其安静后,实施灌胃.
1. 2 灌胃器的制作及饲喂方法
完整的灌胃器主要包括吸料注射针管和送料软管.为实用和制作方便,选取一支 10 mL 或 30 mL的一次性注射器,去除针头,以针管为主要灌胃工具.在针管出口处加上直径匹配的软管,长度为10 cm左右,用医用胶带固定.饲喂时,将已抽取饲料的针管由软管前端从成蛙的侧面嘴角处插进成蛙口中 1cm 左右,一般成蛙就会自己主动取食,将软管吞入胃中,保持不动,当软管被成蛙吞入 5-6 cm时,将针管中的定量饲料推进去,再拔出软管.如果成蛙没有主动吞食软管,就将软管直接沿着食道插入胃中推注.灌胃动作如图 1 所示.
1. 3 灌饲毒物的准备和饲料的调制
实验采用的毒物为一种生物农药---苏云金芽孢杆菌( Bt) 悬浮液( 液体,8 000 IU/mg) ,购自扬州绿源生物化工有限公司.将市售膨化蛙料( 购于南京嘉吉饲料有限公司) 与水按 1∶ 3 比例浸泡后,用搅拌器将饲料搅拌成无颗粒的糊状,使能顺利通过注射器前端,然后按比例添加 Bt 菌剂,并搅拌均匀,使所添加受试物均匀分布在糊状饲料中.
1. 4 成蛙分组及饲养管理
虎纹蛙( Rana rugulosa) 成蛙购自养殖场,选取90 日龄、体质量在 140-220 g 同批次的健康成蛙.对实验蛙进行灌饲训练,以增加其适应性.实验室适应一周后,称体质量并分组.实验共分 1 个空白对照组( C0) 和 5 个苏云金芽孢杆菌( Bt) 剂量组,其剂 量 分 别 为 1 000,2 150,4 640,10 000,21 500 mg / kg,其编号分别为 T1、T2、T3、T4 和 T5,每组 20 只成蛙,每组 4 个重复,每个重复 5 只成蛙,每个重复饲养在 1 个直径为 1 m 的水族箱中,每个水族箱底加 2-3 cm 水,每天清洁水族箱 1 次,清除排泄物.第 1 天灌胃含有 Bt 菌剂的饲料,观察 24 h毒性反应,之后,每天灌胃正常饲料,即未添加毒物的糊状饲料.每只成蛙每次灌胃前称体质量,并按照体质量的 6% 进行灌胃.持续灌胃 14 d,每天观察成蛙的行为并记录成蛙的存活情况,每 7 d 称一次体质量并记录.
1. 5 数据处理
实验数据用 Excel SPSS13. 0 等软件进行统计分析,数据以平均值 ± 标准差( x珋 ± s) 表示.利用 SPSS软件进行机率单位加权回归法 ( Bliss 法) 计算LD50.利用单因素方差分析( One-Way ANOVA) 比较各剂量组 7 d 体质量增加值,14 d 体质量增加值间的差异显着性,以 P <0. 05 为差异有显着性.
2 结果
2. 1 虎纹蛙的死亡率及症状观察
在预实验中,饲喂 Bt 剂量为 2 150 mg/kg 的成蛙全部存活,而饲喂剂量为 21 500 mg/kg 死亡率为100% ,因此,设置 6 个不同的剂量浓度.在灌胃受试物以后,2 h 内观察各剂量组实验蛙均未发现异常,活动正常.3-4 h 后观察,T4、T5 高剂量组蛙开始出现中毒症状,四肢无力瘫软、低头伏于池底,活动迟钝,但拨动其反应仍较大.其余剂量组中毒症状不明显,尤其低剂量 T1 组仍无异常.6-7 h 观察,T5 高剂量组中毒症状明显,皮肤表面干燥失去光泽,腹部膨胀,呈淡绿色中毒症状,拨动时反应呆滞,轻压膨大腹部两侧,有大量的淡黄色液体从肛门流出.低剂量 T1、T2、T3 出现轻微中毒症状,腹部稍微膨大,但仍具正常活动能力.8 h 以后 T5 组开始出现死亡,对死亡个体进行剖解,发现体腔积水,膀胱过度充盈,粪便堆积于直肠,不能排除体外,内脏器官未见明显病变.T5 组 12 h 时死亡率达65% .24 h T5 组全部死亡,T4 组死亡率达 60% ,未死亡的个体反应呆滞,瘫软乏力,惊扰时无反应.低剂量组 T1、T2、T3 组开始出现排便,但粪便不成形.96 h,低剂量组个体浮肿症状消失,排便正常.在7-14 d 的正常灌胃过程中,T3 组在 1-7 d 中陆续死亡 3 只,并出现两只疑似脑膜炎症状,头斜着朝向一边,呈歪脖子状,但在灌胃时仍有主动取食行为.T1、T2 组未发现异常,取食欲望很强( 表 1) .根据第 7 天的死亡情况,计算 LD50为 6691 mg /kg,95%的置信区间为[5 564,8 329]mg/kg.
2. 2 各剂量组成蛙体质量的变化
记录第 7 天和第 14 天成蛙体质量,计算 7 d 体质量增加值和 14 d 体质量增加值.结果见表 2.C0 组,即未添加农药组,其 7 d 和 14 d 体质量增加值最大,而 T3 组增重最小,显着小于其他各组.
3 讨论
3. 1 成蛙经口灌胃的可行性
动物强饲或者灌胃通常被应用在测定禽类饲料营养代谢[14-16]及小鼠、大鼠等消化道染毒[17-19],上述方法在用于蛙类等两栖类动物的研究实践较少.在蛙消瘦的营养状态下,可以通过强饲,对成蛙进行营养补给[20],但灌饲技术还未应用在成蛙的毒性实验中.灌胃方式能做到染毒剂量准确,在毒理学研究中广为应用.我们经过 14 天的灌饲,空白对照组的成蛙无死亡,而且体质量增加( 39. 34 ± 11. 02)mg,较原始体质量增加 21. 6% .根据成蛙的死亡率及其体质量增加情况,我们认为蛙类可以通过灌胃的方式进行给药或补给营养.
3. 2 实验中应注意的问题
成蛙灌胃器的制作与正确使用是成蛙毒性实验能够顺利进行的关键.制作和使用合适的灌胃器不仅可以实现精确给药,也能减少对实验蛙的伤害.在灌胃操作中,要注意: 1) 灌胃器的胶管要直接进入实验蛙的食道甚至胃中,因此,要外表光滑,质地柔软,充满饲料以后能模拟多汁的虫体,减少对实验蛙食道的机械损伤,增加适口感,能够诱使成蛙主动吞食; 同时要具有韧性,以防止成蛙将其咬断; 2) 选用的注射器大小要适中,容积过大,不宜操作,过小,吸料量不足,需要多次添加受试物,影响灌胃速度,增加动物的应激; 3) 在推送饲料时要注意节奏,使饲料慢慢地推入蛙的胃中,防止大量饲料冲击蛙的胃壁,使成蛙不适或呕吐.饲料的调制应反复摸索水、饲料及添加毒物合适的比例,使其能够比较顺利通过注射器.实验前熟练掌握成蛙的灌胃技术是非常必要的.
参 考 文 献
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