乳香为橄榄科植物乳香树及同属植物皮部渗出的树脂,性温,味辛苦,具有活血止痛,消肿生肌之功效。乳香提取物中主要含乳香脂酸及羰基衍生物、四环三萜化合物和大环二萜化合物等。创伤是兽医临床常见的外科病,小的伤口无需治疗靠机体免疫力便可自愈。如果伤口过大,神经、血管损伤严重,就会出现愈合缓慢,甚至发生化脓感染。
受损的神经修复是创伤愈合过程中的一个重要的生物学过程。由于神经的修复不完全,导致创伤愈合效果不理想。乳香提取物有抑制肿瘤细胞生长、抑制炎症反应、提高小鼠免疫力等作用。但其在创伤愈合中神经修复方面的影响报道很少,本试验通过探讨乳香提取物对大鼠皮肤周围神经损伤修复的影响,为乳香在兽药开发和兽医临床上的应用提供依据。
1、材料与方法
1.1材料
试验动物大鼠只,雌雄不限,体质量。主要试剂乳香提取物(购自宝鸡市方昇生物开发有限公司抗体购自北京中杉金桥公司,引物由上海生工公司合成。
1.2动物模型制备
只大鼠麻醉后背部净毛在背中部脊柱两侧各旁开处剪一边长为的正方形伤口,深达肌筋膜,破坏部分肌肉表面筋膜。每日进行创面消毒并于右侧涂抹乳香提取物,分笼饲养。
1.3 观察与检测
1.3.1 标本采集分别于1、4、7、10、个时间点,每个时间点对只大鼠进行取材,乙醚麻醉动物,用剪刀剪取各组动物创面皮缘,约,置于-80℃冰箱中备用;另取部分组织多聚甲醛溶液(含)固定。
1.3.2 创面愈合率5个时间点进行大体拍照并采用软件计算各时期创面愈合率。创面愈合率[(原始创面面积残余创面面积)/原始创面面积×100%。蛋白免疫组化染色石蜡切片进行脱蜡和水化,抗原修复,滴加封闭液;加滴抗体冲洗,滴加生物素标记的二抗冲洗滴加溶液孵育显色,苏木素复染,中性树胶封固。引物由上海生工合成上游引 物5′-TTCTTTGAACGCCTGGAGTCC-3′,下游 引 物5′3′,扩增片段长度。上游引物5′GCTGAACCAATAGCTGCCCG-3′,下游引物5′CGCCTTGACAAAGGTGTGAGTCG-3′,扩增片段长度。β上游引物5′CATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′,下游引物′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′扩增片段长度。
1.4统计方法
采用统计软件包进行统计分析,各组数据采用均数±标准差表示x珔±)及单因素Duncan′方差分析,分析各组间是否有统计学意义为差异显著为差异极显著。
2、结果
2.1乳香提取物对大鼠创伤愈合率的影响
结果见表。创伤后与对照组比乳香提取物处理的大鼠伤口创伤愈合率明显增高,第天时乳香提取物处理的大鼠伤口基本愈合。
2.2 乳香提取物对-100的影响
乳香提取物处理后的大鼠创缘免疫组化结果见图。图为对照组。表皮上层有轻度蛋白阳性反应,部分细胞胞核深染,但数量不多。图为创伤后第天。表皮上层蛋白阳性表达明显增多,大部分细胞都被深染。图为创伤后第天。可清晰观察到阳性表达加深,大多数真皮表层的细胞都被深染。
图为创伤后第天。阳性反应较第天加强,真皮表层细胞深染且向真皮下层扩散,血管周边也出现蛋白阳性表达。图为创伤后第天,阳性表达较第天有所减少。图为创伤后第天。阳性表达有所减少,但大多数表皮细胞被深染。
2.3乳香提取物对基因表达的影响
结果见表。伤后第天表达呈现增多的趋势,第天与第天表达与对照组相比,差异极显著)。
2.4乳香提取物对基因表达的影响
结果见表。伤后第天表达呈现增多的趋势,第1、4、7、与天表达与对照组相比,差异均极显著)。
3、讨论
创伤愈合中神经修复的过程是一个复杂的生物学过程,由于周围神经具有特殊的结构和功能,多数情况下两神经断端无法直接对拉吻合,对接愈合的可能性小,伤后的神经,需要替代物来修复缺损。
是一组低分子量的钙结合蛋白,在中枢神经系统主要影响神经胶质细胞的生长繁殖、分化、维持钙稳态,能促进轴突生长、胶质细胞增生和神经元的分化与钙离子内环境的稳定。雪旺细胞是一种胶质细胞,所有的雪旺细胞都表达蛋白。从免疫组化的结果显示,试验组S-100的阳性结果明显多于对照组,证实了乳香提取物中一种或多种成分能促进雪旺细胞增殖,从而促进周围神经再生。
也是与周围神经再生密切相关的蛋白质,其作用十分广泛在周围神经系统,主要有保护神经元,促进轴突再生促进雪旺细胞增殖,促进血管发生改善血液供应等多种功能。有学者研究表明还能通过活化细胞外信号调节激酶和磷脂酰肌醇激酶途径保护神经组织免受一些继发性损伤,并可促进受损神经元的修复和再生。创伤发生后,随着伤口愈合进程,试验组的表达较对照组在第和天差异显著。证实了乳香提取物可能是通过促进表达来实现促进周围神经再生的。
是最早发现的一种神经营养因子。有研究表明周围神经损伤后,损伤远端及其平均水平增高数倍。神经细胞在正常情况下基本不表达但损伤由自断处向下至靶组织之间的雪旺细胞开始表达。试验结果显示,在创伤后第和天的表达达到峰值,证明在此期间周围神经正在修复。
本试验以创伤大鼠为试验模型,采用自身对照的方法,探讨乳香提取物对大鼠创伤愈合过程中神经修复的影响。本试验结果显示,乳香提取物能促进神经细胞增殖,促进表达,但其具体作用机制有待更深入的研究。
