探究不同浓度的臭氧水对非洲猪瘟病毒的杀灭效果

　　非洲猪瘟论文第四篇：探究不同浓度的臭氧水对非洲猪瘟病毒的杀灭效果

　　摘要：生物安全仍是当前防控非洲猪瘟的最重要措施。然而，在猪场的各个生物安全环节中，对员工食材的消毒尚未见较好的方法。臭氧消毒是多场景中均可使用的消毒方式。因此，为了探究臭氧溶于水后对非洲猪瘟病毒（ASFV）的杀灭效果，试验通过臭氧水与ASFV的作用后的红细胞吸附（HAD）试验来判定臭氧水对ASFV的杀灭效果。试验结果显示：10 m L浓度为2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水与100μL的3.0×104拷贝数的ASFV作用2 min、5 min和10 min时，HAD结果均为阴性，表明2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水作用于100μL的3.0×104拷贝数的ASFV 2 min、5 min和10 min时，均可完全杀灭病毒。以上试验表明，臭氧水在不同作用时间下对ASFV具有较好的杀灭效果。

　　关键词:臭氧;非洲猪瘟病毒;杀灭效果;

　　非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）引起的急性、烈性和高度接触的传染性疾病[1]。2007年以前，ASF在撒哈拉以南国家流行，随后一株高度毒力的ASFV被带到高加索地区，开始在东欧和俄罗斯传播[2]。2018年8月，ASF在中国的东北部暴发，随后席卷全国，对经济社会产生巨大影响[3]。ASF被世界动物卫生组织设定为法定报告的动物疫病，而且属于我国重点防范的一类动物疫情。ASFV是非洲猪瘟相关病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）的唯一成员，也是唯一的虫媒DNA病毒，其基因组为双链DNA，大小为170 kb～190 kb之间，病毒粒子的外形近似六边形，直径约200 nm[4]。软蜱是ASFV的重要传播媒介，最早在非洲东部和南部的发现，没有携带ASFV的软蜱，由于叮咬携带ASFV的病猪，也会成为ASFV潜在的传染源，再次叮咬阴性疣猪时，使其感染ASFV。ASFV在野生猪群中通过蜱作为中间宿主在猪群传播[5]。同时ASFV也可以通过空气或附着在ASFV污染物的表面进行传播[6]。ASFV可以引起家猪和野猪特征性出血和发热，临床症状表现为发烧、皮肤发绀和多脏器广泛性出血，强毒株感染时死亡率高达100%。由于ASFV的对机体免疫机制的影响极为复杂，基因型多，因此没有有效疫苗用于防控[7]。ASFV作为最具破坏性的病毒之一，对动物健康、国民经济和人民生活构成巨大威胁。目前我国养殖业针对ASFV采取的措施主要是以预防为主，在猪场原材料和人工等方面严格把控，一切原材料进入猪场之前进行严格的杀菌和消毒，以控制ASFV的传入。消毒剂作为杀灭ASFV常用的主要消毒产品在猪场被广泛使用。而臭氧作为消毒剂具备以下几个特点。首先，臭氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，且臭氧在水中杀菌速度是液氯的3000倍以上。其次，臭氧杀菌速度是急速的，当浓度超过一定阈值后，消毒杀菌甚至可以瞬间完成。并且臭氧利用其强氧化性能消毒，不产生有害生成物，剩余臭氧会自行分解为氧气，因而不产生残余污染[9]。臭氧气体和臭氧水消毒为臭氧常见的消毒方式，应用控制简单、方便、经济。由于臭氧特有的优势，其在食品处理中有很多附加价值，如无须使用化学药剂，没有化学副产物，减少成本支出，使用环境更安全。基于臭氧的这些特点，食品行业采用高浓度臭氧水进行食品杀菌，主要应用于员工洗手消毒、食品行业器械消毒、大小型蔬果处理厂、食品加工业和定点清洁。因此，为了探究将臭氧消毒应用于猪场内食品的消毒是否切实可行，本试验模拟了猪场内员工食材消毒场景，初步探究了不同浓度的臭氧水对ASFV杀灭效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　ASFV病毒粒子、猪红细胞、PAMs细胞、96孔细胞培养板、1640培养基、胎牛血清、臭氧水机：“瑞净活氧水机”（DT-01C、12W）、“杭州陆恒生物”臭氧水浓度检测仪M900。

　　1.2 方法

　　1.2.1 臭氧水机不同作用时间下臭氧水浓度变化

　　启动臭氧水机，将水槽内注满自来水，在不同作用时间后，使用“杭州陆恒生物”臭氧水浓度检测仪M900测定臭氧水浓度，探究臭氧水随时间变化曲线。

　　1.2.2 探究震荡对臭氧水浓度的影响

　　将3.0 ppm臭氧水取出装至50 m L离心管内，漩涡震荡15 s，使用“杭州陆恒生物”臭氧水浓度检测仪M900测定臭氧水浓度，探究臭氧水浓度随着震荡时间变化曲线，探究震荡是否能够消除水中溶解的臭氧。

　　1.2.3 臭氧水杀灭ASFV效果探究

　　探究不同臭氧水对ASFV杀灭效果的试验分为三组：试验组，阳性对照组和阴性对照组。试验组：2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水10 m L与病毒悬液（病毒拷贝数为3.0×104）分别作用2 min、5 min和10 min。病毒阳性对照组：无菌水10 m L与100μL的病毒悬液（病毒拷贝数为3.0×104）分别作用2 min、5 min和10 min。作用结束后，震荡去除水中溶解的臭氧，再接种于提前铺有PAMs细胞的96孔细胞培养板，孵育2 h后，置37℃二氧化碳培养箱中培养。病毒阴性对照组：无菌水10 m L震荡，再接种于提前铺有PAMs细胞的96孔细胞培养板，每个实验组设置8个重复，孵育2 h后，置37℃二氧化碳培养箱中培养。分别向上述三组不同处理实验组中加入猪红细胞，观察是否存在红细胞吸附现象。以上涉及ASFV活病毒的试验均在华南农业大学动物生物安全三级实验室内开展。

　　2 试验结果

　　2.1 臭氧水机不同作用时间下水中臭氧浓度变化

　　臭氧水机不同作用时间下水中臭氧浓度变化（方差S2为1.0506）如图1所示，随着臭氧水机的开启，水中臭氧浓度逐渐上升，并于45 min时到达5.2 ppm,45 min后，在臭氧水机开启的情况下水中臭氧浓度一直保持在5.0 ppm以上。

　　图1 臭氧水机不同作用时间下水中臭氧浓度变化曲线   

　　2.2 震荡对臭氧水浓度的影响

　　震荡对臭氧水浓度的影响（方差S2为1.02164）如图2所示，随着漩涡震荡时间的增加，臭氧水的浓度逐渐降低，并于75 s接近0 ppm，表明震荡可有效去除水中溶解的臭氧，可用于中止臭氧反应试验。

　　图2 臭氧水浓度随着震荡时间变化曲线  

　　2.3 臭氧水杀灭ASFV效果探究

　　臭氧水杀灭ASFV的结果如表1所示：阴性对照（空白对照组）HAD结果为阴性，表明试验过程操作严谨，试验无污染。阳性对照（病毒组）与无菌水作用2 min、5 min和10 min时，HAD结果均为阳性，表明病毒活性良好，试验切实可行。臭氧水试验组，10 m L浓度为2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水与100μL 3.0×104拷贝数的ASFV作用2 min、5 min和10 min时，HAD结果均为阴性，表明2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水与均100μL3.0×104拷贝数的ASFV作用2 min、5 min和10 min时，均可完全杀灭病毒。

　　表1 臭氧水杀灭ASFV效果探究    

　　注：“-”代表HAD阴性，表示病毒被完全杀灭；“+”代表HAD阳性，表示病毒未被完全杀灭

　　3 讨论

　　2018年8月，ASFV入侵我国，随后政府立即发布了相关防控政策，但ASF仍在一年内迅速蔓延至中国大陆各省。到目前为止，ASF疫情在我国尚未得到完全的控制。ASFV在猪群中的持续感染，大量的猪只被扑杀，引起了猪群数量和生猪产量的剧烈波动，导致猪肉价格的剧烈波动，对我国生猪产业和经济发展带来了挑战。ASF在我国的出现和迅速蔓延，表明我国针对外来动物疾病的生物安全体系存在薄弱环节，因此我们需要提高生物安全意识，完善猪场生物安全体系[8]。目前我国猪场生物安全防控的措施主要从三方面入手：第一，建立良好的生物安全屏障；第二，建立良好的消毒和无害化处理措施；第三，提高猪场工作人员的生物安全意识。良好的消毒措施对于控制ASFV的传播至关重要。目前国内猪场主要采取消毒剂的方式对猪场进行消毒，主要以强酸、强碱、强氧化剂、季铵盐和卤素类消毒剂为主，虽然对病原体有较好的杀灭效果，但大部分消毒剂对猪和人有一定危害，且对猪场内员工食材并非是较好的消毒方法[10]。臭氧作为消毒剂具有高效性、广谱性、无污染等特点。考虑到臭氧消毒的优越性，本试验模拟了猪场内员工食材消毒场景，证实了臭氧水对ASFV有较好的杀灭效果。可见，将臭氧水应用于猪场内员工食材的清洗和消毒是一种较优的补充生物安全措施的方式。

　　4 结论

　　试验表明，臭氧水在不同作用时间下对ASFV具有较好的杀灭效果，可考虑将臭氧水应用于猪场内员工食材的清洗和消毒。

　　参考文献

　　[1] SANCHEZ-CORDON P J,MONTOYA M.REIS A L.et al.Afric an swine fever.A re emerging viral disease threatening the global pig industry[J].Veterinary Journal,2018,233:41-48.

　　[2] CWYNAR P,STOJKOV J,WL AZLAK K. African swine fever status in europe[J]. Viruses 2019.11(4):310.

　　[3] GE S,LI J,FAN X,et al. Molecular Characterization of African Swine Fever Virus, China, 2018[J] Emerging Infectious Diseases ,2018,24(11):2131-2133.

　　[4] GALINDO 1.ALONSO C African swine fever virus:A review[J].Viruses,2017.9(5):103.

　　[5] JORI F.VIAL L,PENRITH M L,et al.Review of the sylvatic cycle of African swine fever in sub- Saharan Africa and the Indian ocean[J].Virus Research,2013,173(1):212-227.

　　[6] BOINAS F S,WILSON A J,HUTCHINGS G H,et al. The persistence of African swine fever virus in field-infected Ornithodoros erraticus during the ASF endemic period in Portugal[J].PLoS One,2011 ,6(5):e20383.

　　[7] DIXON L K,STAHL K,JORI F,et al. African swine fever epidemiology and control[J]. Annual Review of Animal Biosciences,2020.8(1):221-246.

　　[8]LU G,CAI S,ZHANG G. African swine fever in China one year on[J]. Veterinary Record.,2019,185(17):542.

　　[9]臭氧杀菌特点与产生方法比较[J].食品安全导刊，2008(01):58-59.

　　[10]孙刚.论养猪场消毒的方法[J]农民致富之友，2018(02):229.