神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是一类分布于神经系统，具有自我更新并拥有多向分化潜能的干细胞，其主要分化为星形胶质细胞、神经元细胞及少突胶质细胞，替代受损的神经组织从而起到治疗脊髓损伤的作用[1 -2].骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs）属于成体干细胞的一种，不仅具有成骨、成脂等多向分化潜能，还能分泌多种神经营养因子[3],近年来利用 BMSCs与 NSCs 共培养技术治疗脊髓损伤已成为研究热点。有报道[4]指出，BMSCs 与 NSCs 共移植治疗神经损伤疗效优于单纯移植 NSCs,说明 BMSCs 为NSCs 的生长与分化提供了一个更加合适的微环境。
然而，是 BMSCs 本身还是其分泌的营养因子发挥了作用仍值得探讨。该研究利用富含营养因子的BMSCs 条件培养基体外培养 NSCs,去除 BMSCs 本身的影响，能够充分了解 BMSCs 条件培养基对NSCs 增殖与分化的影响，为 BMSCs 条件培养基的应用提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物 新生 24 h 内 SD 大鼠 1 只，雌雄不限；4 ~5 周龄 SD 大鼠1 只，100 ~120 g,购自安徽医科大学实验动物中心。
1. 1. 2 实验试剂及仪器 DMEM /F12 培养基（ 美国 Gibco 公司）；DMEM 低糖、南美胎牛血清（美国HyClone 公司） ;B-27（ 美国 Invitrogen 公司）；表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）（美国PeproTech 公司）；小鼠抗大鼠巢蛋白（ Nestin） 抗体、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidicprotein,GFAP） 抗体、小鼠抗大鼠微管相关蛋白-2（microtubule-associatedprotein-2,MAP-2）（美国 SantaCruz 公司）；小鼠抗大鼠髓鞘碱性蛋白（ myelin basicprotein,MBP）（英国 Abcam 公司）； FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG、TRITC 标记的山羊抗兔 IgG、TritonX-100（北京中杉金桥生物技术有限公司）；CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD44-FITC（美国 BioLegend公司）；多聚赖氨酸（美国 Sigma 公司）；MTT 试剂盒、胰 酶、免 疫 荧 光 稀 释 液、多 聚 甲 醛、Hoechst33342、青链霉素（ × 100） （ 上海碧云天生物技术有限公司）；山羊血清（中国武汉博士德公司）；ECL 显示试剂盒（美国 Pierce 公司）；CO2恒温培养箱（美国SHEL LAB）；倒置显微镜 CKX41 （ 日本 Olympus 公司）；流式细胞仪（美国 BD FACSVerseTM）；荧光显微镜 DMI6000 型（德国 Leica 公司）。
1. 2 方法
1. 2. 1 大鼠 BMSCs 体外分离、培养、鉴定 采用本课题组前期的实验方法[5]从大鼠骨髓中分离并培养出 BMSCs,取生长良好的第 3 代 BMSCs,胰酶消化后制成单细胞悬液，计数，参照之前的方法，行细胞表面标记 CD90、CD34、CD29 的流式细胞仪检测。
1. 2. 2 大鼠 BMSCs 条件培养基的制备 取第 3 代生长良好的 BMSCs,待细胞长至约 90 % 密度时，弃去原培养基，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min; 加入DMEM / F12 培养基继续培养 48 h 后，收集浓缩上清液，按前期实验比例配制成 NSCs 增殖与分化条件培养基。
1. 2. 3 大鼠 NSCs 的分离、培养、鉴定 取新生 24h SD 大鼠幼鼠，处死后置于 75% 酒精浸泡 5 min;在无菌条件下分离出大脑半球，剪碎，加入 0. 25% 胰酶消化 10 min,轻轻吹打混匀后经筛网过滤成单细胞悬液；加入增殖培养基（DMEM/F12 +2%B27 +20ng / ml bFGF + 20 ng / ml EGF + 链霉素 0. 1 mg / ml +青霉素 100 U/ml），600 r/min 离心 5 min 2 次，弃上清液；吹打混匀后以 3 ×105/ ml 接种于培养瓶中，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每 3 d 半定量换液1 次，培养 7 d 后传代。
取第 2 代培养 7 d 的细胞球，600 r/min 离心 5min,弃上清液，接种于经 0. 1 mg/ml 多聚赖氨酸包被盖玻片的 6 孔板中，置于 37 ℃培养箱 6 h,使悬浮干细胞贴壁。用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min;4%多聚甲醛固定后，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min.在含0. 3% TritonX-100 中孵育 10 min,PBS 洗 3 次后，加入正常山羊血清封闭液，置于 37 ℃ 细胞培养箱内孵育 1 h 后，加入 1 ∶ 50 稀释 Nestin 一抗，4 ℃ 条件下孵育过夜。次日常温下放置 2 h,PBS 洗涤 3次，每次 5 min,加入 1 ×100 稀释 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG,37 ℃ 细胞培养箱内避光孵育 1 h.最后行 Hoechst 溶液核染后封片，荧光显微镜下观察、拍照。
1. 2. 4 大鼠 NSCs 分化及分化后鉴定 取第 2 代培养 7 d 的 NSCs 球，600 r/min 离心 5 min,弃上清液；加入分化培养基（DMEM/F12 + 2% B27 + 链霉素 0. 1 mg/ml + 青霉素 100 U/ml +10% FBS），吹打混匀后，接种于经 0. 1% 多聚赖氨酸包被盖玻片的6 孔板中；置于 37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养 1 周，每 3 d 半定量换液 1 次。1 周 后，参照上述免疫荧光方法，行神经元特异性蛋白 MAP-2、星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP、少突胶质细胞特异性蛋白MBP 的免疫荧光染色。
1. 2. 5 大鼠 BMSCs 条件培养基在增殖情况下对大鼠 NSCs 增殖的影响 取第 2 代培养 7 d 生长良好的 NSCs,600 r/min 离心 5 min,吹打均匀。实验组换用 BMSCs 条件培养基在增殖条件下放入 96 孔板中培养，每孔细胞数约 2 ×104个，对照组放入 96 孔板中继续增殖培养基培养。分别在培养 1、3、5 d时，每次每组取 6 孔行 MTT 检测，利用细胞生长曲线的绘制，了解大鼠 BMSCs 条件培养基在增殖条件下对 NSCs 的影响。MTT 检测：每孔加入 5 × 10- 3g / ml 的 MTT 溶液 20 μl,置于 37 ℃ 温箱 4 h 后取出，弃上清液；每孔加入 DMSO 150 μl,振荡 10 min混匀后，用酶标仪测定光密度（optical density,OD）值；每个样品取 6 孔，算出平均值后绘制曲线。
另外，取第 2 代培养 7 d 生长良好的 NSCs 接种至 6 孔板中，每孔接种细胞数为 1 × 106,培养方法同上，观察细胞形态变化。在培养第 5 天时，实验组与对照每组取 3 孔，在显微镜下（ ×100），按照双盲法，每次每组各取 10 个视野对 NSCs 球进行计数，同时每组选取 10 个细胞球利用 Image J 图像处理软件测量其直径（直径的最大值/2 + 最小值/2）。
1. 2. 6 大鼠 BMSCs 条件培养基在分化情况下对大鼠 NSCs 分化的影响 取第 2 代培养 7 d 的 NSCs球，600 r/min 离心 5 min,弃上清液，重悬后计数，接种于经 0. 1% 多聚赖氨酸包被盖玻片的 6 孔板中，每孔细胞数约 1 ×106.实验组换用大鼠 BMSCs 条件培养基在分化条件下培养，对照组在无条件培养基条件下分化。置于 37℃、5% CO2培养箱中培养 1周，每 3 d 半定量换液 1 次。1 周后，分别提取分化后细胞总蛋白并测定蛋白浓度，根据蛋白浓度选择上样量，依次行电泳、转膜、封闭；加一抗于 4 ℃ 孵育过夜，次日洗膜，加入相应蛋白二抗，室温孵育 2h,充分洗涤后显影、定影。所使用抗体及稀释度：
MAP-2（小鼠单抗，1 ∶ 200 稀释），GFAP（兔多抗，1 ∶ 500 稀释），MBP（ 小鼠单抗，1 ∶ 500 稀释），β-ac-tin（ 小鼠单抗，1 ∶ 1 000 稀释），二抗 （ 山羊抗鼠，1 ∶ 5 000稀释；山羊抗兔，1 ∶ 5 000 稀释） .胶片扫描后采用 Image J 软件分析各组条带的灰度值。
1. 3 统计学处理 应用 SPSS 11. 0 统计软件进行分析，计量资料以 x珋 ± s 表示；两组间均数比较采用独立样本 t 检验，组间差异采用单因素方差分析；所有实验每次至少 3 组，独立重复 3 次。
