乳腺癌GRB7蛋白与HER2基因及蛋白表达

　　摘 要：目的 研究GRB7蛋白在乳腺癌中表达的意义。方法 回顾性分析110例乳腺浸润性导管癌临床病理资料， 采用免疫组化法 （IHC） 检测GRB7蛋白的表达情况， 分析GRB7蛋白表达及临床病理意义， 并同时采用荧光原位杂交 （FISH） 和免疫组化检测HER2基因和蛋白， 研究GRB7蛋白与HER2基因相关性。结果 110例乳腺癌GRB7评分：01+57例 （51.8%） , 23+53例 （48.2%） ;GRB7过表达与淋巴结转移、肿块体积大、组织学分级高及Ki-67的指数高等临床病理特征有关， 而与ER、PR及发病年龄无关；HER2基因扩增36例 （32.7%） , 与GRB7的结果相关 （P<0.05） .结论 GRB7表达与HER2基因表达存在着一致性， 可能依赖HER2的扩增与表达， 是乳腺癌预后的重要生物学标记， 可能成为新的药物靶点。
　　
　　关键词：乳腺癌； GRB7; 临床病理； 预后；
　　 　　Abstract:  Purpose To investigate the significance of the expression of GRB7 in breast cancer.Methods The clinicopathological characteristics of 110 cases of breast cancer were retrospectively reviewed and Immunohistochemical expression of GRB7 on tumor tissuse and clinical pathological features were analyzed, and at the same time fluorescence in situ hybridization （ FISH） was used to detect the expression of HER2 gene in 110 cases of invasive breast cancer, and to compare the correlation with GRB7 protein.Results The results of GRB7 in 110 cases of breast cancer patients showed that scores 0-1 + were found in 57 cases （ 51.8%） , and 2-3 + in 53 cases （ 48.2%） .The higher expression of GRB7 was associated with lymph node involvement, larger primary tumor size, higher tumor grade, and higher Ki67, but not associated with ER and PR status and age.HER2 gene amplification was detected in 36 cases （ 32.7%） .There was correlation between HER2 and GRB7 （ P < 0.05） .Conclusions The expression of GRB7 and HER2 in breast cancer is consistent, and the expression of GRB7 protein may depend on the amplification and expression of HER2.GRB7 is an important biomarker for prognosis of breast cancer and might become a better target for the treatment of certain molecular subtypes of breast cancer.
　　
　　Keyword: Breast cancer; GRB7; Clinical pathology; Prognosis;
　　
　　人类表皮生长因子受体蛋白2 （HER2） 在浸润性导管癌中阳性表达， 已经成为曲妥珠单抗的治疗靶点， 并已广泛应用于临床， 但因费用昂贵且具心脏毒性一直存在较大争议[1].因此， 寻找乳腺癌新的治疗靶点正成为热点。生长因子受体结合蛋白-7基因 （GRB7） 作为与HER2一样位于17q12-21的基因位点， 被认为与乳腺癌、胃癌、食管癌等多种肿瘤的发生、发展有密切相关性， 但研究甚少[2].尤其在乳腺癌中有关GRB7表达与各临床病理特征之间的关系以及与HER2的关系， 国内外研究得较少， 仅见零星报道[3].本文通过IHC与FISH法检测乳腺癌GRB7蛋白与HER2基因及蛋白表达， 探讨它们之间的相关性， 以及和各临床病理特征之间的意义， 为今后乳腺癌患者选择合适的个体化治疗方案提供分子理论依据。
　　
　　1、 材料与方法
　　
　　1.1、 材料
　　
　　选取九江市第一人民医院病理科2011-06-2016-06间未经放化疗的乳腺浸润性导管癌存档组织标本110例为实验组， 均为女性， 中位年龄44.5岁。同时随机选取20例实验组的癌旁正常乳腺组织 （距癌旁1 cm组织） 设立对照组。
　　
　　1.2、 方法
　　
　　1.2.1、 免疫组化
　　
　　GRB7鼠抗人单克隆抗体 （工作浓度1∶100） 购于上海艾博康贸易有限公司。HER2为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。所有乳腺癌蜡块标本均经临床、影像及高年资病理医师确诊。常规石蜡4μm切片。免疫组化采用SP法。实验组及对照组均采用同种处理方法。用PBS液替代一抗作阴性对照。
　　
　　1.2.2、 FISH
　　
　　HER2基因的检测试剂盒购自于北京金菩嘉公司， 所有操作按照试剂盒步骤进行。白片组织脱蜡、脱二甲苯后， 胃蛋白酶孵育15 min, 再次洗涤、干燥后， 加入10μl探针。杂交仪中37℃过夜， 72℃暗室干燥， 加入10μl DAPI显色液。正常乳腺组织和对照片同时作为阴阳对照， 荧光显微镜镜检。
　　
　　1.3、 结果判定
　　
　　1.3.1、 免疫组化
　　
　　依据美国临床肿瘤学会ASCO分级对GRB7和HER2行结果判读。GRB7阳性呈棕黄色定位于胞膜或胞质：肿瘤细胞染色阳性<5%、5%~25%、26%~50%、>50%, 分别计数 （0~3+） .HER2阳性呈棕黄色定位于胞膜：肿瘤细胞膜染色≤10%、微弱不完整膜染色≥10%、弱完整膜染色≥10%、强完整膜阳性≥10%, 分别计数 （0~3+） .
　　
　　1.3.2、 FISH
　　
　　依据美国临床肿瘤学会ASCO的HER2检测指南， 根据试剂盒DNA探针说明， 绿色信号为17号染色体丝粒 （CEP17） , 红色信号为HER2基因。随机计数30个肿瘤细胞， HER2/CEP17信号比≥2为阳性， 即HER2基因存在扩增；HER2/CEP17信号比<2为阴性， HER2基因无扩增。
　　
　　1.4、 统计学分析
　　
　　所有数据采用SPSS18.0统计软件处理并行相关性分析。
　　
　　2、 结果
　　
　　2.1、 GRB7与临床病理特征间的关系
　　
　　GRB7在乳腺癌中高表达率为48.3%, 在正常乳腺组织中一般弱表达或阴性。20例中仅1例高表达， 占比为5% （1/20） .GRB7高表达与肿瘤淋巴结转移 （χ2=8.643, P<0.05） 、肿瘤体积较大 （χ2=11.396, P<0.01） 、组织学分级高 （χ2=9.463, P<0.05） 及Ki-67指数高 （χ2=13.101, P<0.01） 密切相关， 但与ER、PR及年龄无关 （表1） .
　　 　　
　　2.2、 HER2表达及基因扩增
　　
　　免疫组化检测乳腺癌HER2表达评分0~1+、2+和3+ （图1） 的病例占比分别为49.1% （54/110） 、23.6% （26/110） 和27.3% （30/110） , 正常乳腺组织HER2为 （-） .FISH检测共计36例基因扩增 （+） （图2） , 74例为 （-） （图3） , 与免疫组化HER2评分0~1+、2+和3+符合率分别为0、30.8%和93.3%.HER2的免疫组化及FISH检测结果存在正相关性 （r=0.78, P<0.05） （表2） .
　　 　　
　　2.3、 GRB7与HER2的相关性
　　
　　与HER2表达评分对比， 110例乳腺癌标本中免疫组化方法检测GRB7表达评分0~1+和2~3+ （图4） 的病例占比分别为51.8% （57/110） 和48.2% （53/110） , HER2与GRB7的表达存在强相关性 （r=0.83, P<0.05） （表3） .
　　 　　
　　3、 讨论
　　
　　细胞内存在许多SH2结构蛋白， 这些蛋白参与信号传导的级联酶促反应。GRB7蛋白是最近发现的一类编码多域的接头蛋白， 具有较多SH2蛋白， 含有535个氨基酸残基， 有3种功能区域， 分别为富含脯氨酸的功能区N端、中间的GM区和位于C端的SH2结构域[4].它主要通过将信号从多种细胞表面受体介导到各种下游信号的通路而发挥作用。人体内GRB7在胰腺中高表达， 认为GRB7主要是通过SH2结构域与胰岛素受体结合， 广泛参与表皮生长因子、成纤维细胞生长因子受体和胰岛素信号转导等各种信号转导通路。在很多肿瘤组织中， 尤其是在侵袭的乳腺癌中， GRB7蛋白处于高表达状态， 促进HER2阳性的乳腺癌细胞的生长和迁移[5], 而且是Erb B2介导的肿瘤发生的下游关键介子[6], 其蛋白域相互作用及功能特异性有希望成为乳腺癌新的化疗靶点。HER2为目前研究比较透彻的一类具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白质， 由结合区和胞内区组成， 分子质量约为185 k Da, 包含23个氨基酸。由于其能促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡；并能通过上调VEGF/VPF削弱机体屏障， 促进肿瘤内新生血管生长， 从而增加恶性肿瘤的侵袭力[7].乳腺癌的发生被证明与人类17号染色体存在密切关系。17号染色体由8100万个碱基构成， 含有1500个基因片段， 其DNA编码存在多片段重复性， 参与了多种蛋白表达及基因编码[8].HER2和GRB7是同时位于17q12-21的基因位点， 与乳腺癌的发生、发展存在密切相关性。
　　
　　乳腺癌治疗主要以传统的手术、放化疗、内分泌治疗为主， 近年来已明确了曲妥珠单抗为HER2阳性乳腺癌的治疗靶点， 联合辅助化疗可以明显提高HER2阳性乳腺癌的疗效[9].但是未扩增的17号染色体HER2阴性， 及转移性血清HER2阳性的乳腺癌预后仍不佳[10,11].因此， 寻找新的靶点是当今乳腺癌研究的热点。
　　
　　本研究通过免疫组化方法测定110例GRB7蛋白表达状态与临床病理特征之间的关系， 并应用FISH检测HER2基因扩增的情况并初步探讨与GRB7蛋白之间的关系。发现GRB7在乳腺癌中高表达与肿瘤淋巴结转移、肿瘤体积较大、组织学分级高及Ki-67指数高均密切相关， 但与ER、PR及年龄无关。认为GRB7蛋白过表达是乳腺癌不良预后的独立因素[12].HER2免疫组化2+、3+阳性表达率占所有乳腺癌检查的50.9%, 而GRB7免疫组化2+、3+阳性表达率占所有乳腺癌检查的48.2%, 两者阳性表达率相近， 提示两者免疫组化表达存在明显的正相关， GRB7蛋白的表达可能依赖HER2的扩增与表达。有研究表明， 乳腺癌细胞在表皮生长因子的刺激下， 与表皮生长因子受体结合的GRB7络氨酸被磷酸化， 并成为Ras-GTP酶的结合点， 进而激活下游的ERK相关的信号通路， 从而刺激肿瘤生长[13].110例乳腺癌FISH检测结果显示， 基因扩增共计36例， 多见于HER2免疫组化2+、3+病例。通过相关性分析发现 （r=0.78） , 免疫组化及FISH检测结果存在强相关性， 这与目前大多数学者已发表的研究结果类似， 进一步明确HER2蛋白和基因的关系。本次研究通过初步探讨HER2与GRB7在乳腺癌中表达的关系， 印证了乳腺癌HER2蛋白与基因扩增的一致性， 且蛋白的表达依赖HER2的扩增与表达。同时显示HER2与GRB7在乳腺癌细胞中表达存在强相关性， 提示GRB7在乳腺癌浸润、转移过程中发挥了重要作用， 如抑制肿瘤细胞中GRB7的高表达， 或许可以提高HER2抑制剂的抑制效果。有研究表明， 环肽结合磷酸化络氨酸可能成为GRB7的新靶点[14].GRB7将是一个重要的靶分子， 有效抑制肿瘤的转移、延长患者生命。
　　
　　本研究显示， 在乳腺浸润性导管癌中， GRB7的高表达与多种临床病理特征密切相关， 是评估乳腺癌预后的指标， 其表达可能依赖HER2基因扩增。GRB7可能成为一个重要的靶分子， 将有效抑制肿瘤转移， 延长患者生存期。但目前对于GRB7下游信号分子了解不多， 接下来的研究方向是明确GRB7蛋白的作用， 构建GRB7参与细胞信号的完整通路， 为肿瘤的靶向治疗提供新的方向。
　　
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