甘丙肽(GAL)是近年来发现的一种神经肽,其N和C端分别为甘氨酸和丙氨酸残基[1].根据其分子结构分析,GAL可能是区别于其他家族而独立存在的一种神经肽,它广泛存在于外周神经系统和中枢神经系统中,具有促进生长激素和缩宫素释放、调节消化和生殖系统平滑肌收缩、抑制胰岛素分泌等生理功能[2-3].下丘脑-垂体-睾丸轴是调控雄性生殖功能的主要通路,有研究报道,GAL可增强促性腺激素释放激素(GnRH)作用,促进黄体生成激素(LH)分泌,提示GAL可能通过中枢调控参与下丘脑-垂体轴的功能调节[4].但国内外有关GAL在睾丸、附睾的表达及其对雄激素产生和精子发生调控作用的研究报道较少.因此,本研究旨在探讨GAL在啮齿类动物睾丸、附睾组织中有无表达,明确其定位,为进一步研究GAL在雄性生殖系统中的功能提供理论依据和实验资料.
1材料与方法
1.1动物
10只SPF级C57雄性健康小鼠,体重(20~24)g,12周龄,由维通利华实验动物研究所提供,常规饲养,动物许可证号:scxk-(京)2012-0004.
1.2试剂
GAL一抗购自英国Abcam公司;SP试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司;其余试剂为国产分析纯.
1.3组织标本的采集与处理
断颈处死动物,取出睾丸和附睾组织,迅速投入Bouin's液固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片3μm,免疫组织化学染色在标本收集后4周内完成.
1.4免疫组织化学染色
组织石蜡切片脱蜡至水后,3% H2O2孵育15min消除内源性过氧化物酶的活性,1% Triton X-100浸泡15min增加组织穿透性,5%正常羊血清室温封闭25min后,滴加一抗(1：1000),4℃过夜.恢复室温40min,0.01mol/L(pH 7.2~7.4)PBS洗2次,5min/次;滴加生物素化二抗,37℃孵育1h,PBS洗2次,5min/次;滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素,37℃孵育25min,PBS洗2次,5min/次;加DAB显色液作用2~5min,终止反应,双蒸水充分洗涤;常规脱水、透明、封片.以缓冲液替代一抗为阴性对照,以海马组织为阳性对照.光镜下观察,细胞质或细胞核中呈现棕黄色颗粒为阳性.
2结果
在睾丸组织中,GAL免疫阳性染色定位于间质细胞、支持细胞和各级生精细胞(包括精原细胞、初级精母细胞和精子细胞 ),主要表达于胞膜及胞质(图1-A).在附睾组织中,GAL阳性染色主要表达于附睾管高柱状细胞、低柱状细胞的胞膜及胞质,附睾管上皮的亮细胞、晕细胞及基细胞未见阳性表达,附睾间质也为阴性(图1-B、C、D);GAL在附睾体和尾部表达较强,在头部远段表达较弱.图1-E为睾丸阴性对照,图1-F为海马阳性对照.
3讨论
GAL是Tatemoto于1983年从猪小肠提取物中发现的一种29肽,目前对GAL的研究主要集中在神经系统和内分泌系统.研究表明,GAL的mR-NA在大鼠和小鼠的下丘脑和脑干区域含量最多,并且GAL和多种传统神经递质及神经肽共存[5-6].
低浓度GAL脑室注射可促进GnRH释放,且GAL可通过其受体直接作用下丘脑GnRH神经元,促进LH分泌,提示GAL可能在下丘脑-垂体-生殖轴方面发挥重要生理作用[7-9],但GAL在雌雄动物生殖器官表达和定位尚无报道.本实验结果显示,GAL在睾丸间质细胞中有表达.间质细胞是具有分泌类甾体激素功能的细胞,间质细胞分泌的雄激素有促进精子发生、促进男性生殖器官的发育与分化以及维持第二性征和性功能等作用.推测GAL可能参与了睾酮的分泌过程.
GAL在支持细胞,生精细胞呈阳性表达,推测GAL在精子生成过程中可能发挥作用.此外,本实验结果显示,GAL在附睾有表达,提示附睾组织可能具有合成GAL的能力,调节其自身的吸收和分泌功能,进而影响附睾管腔液的组成及精子成熟的微环境,参与精子的睾丸后成熟.
本文研究了GAL在小鼠睾丸、附睾的表达定位和特点,提示它们可能以自分泌或旁分泌的形式共同调节睾丸和附睾的微环境,影响精子的发生、发育和成熟,但要完全阐明它们在雄性生殖中的作用仍需深入研究.本文证明了GAL在小鼠睾丸和附睾组织中的广泛分布,为今后研究GAL在小鼠生殖系统的功能奠定了基础.
参考文献
[1]Tatemoto K,R?kaeus A,J?rnvall H,et al.Galanin-a novelbiologically active peptide from porcine intestine[J].FEBSLett,1983,164(1):124-128.
[2]Argiolas A,Melis MR.Neuropeptides and central control ofsexual behaviour from the past to the present:areview[J].Prog Neurobiol,2013,108:80-107.
[3]Kong Q,Yu LC.Antinociceptive effects induced by intra-peri-aqueductal grey injection of the galanin receptor 1 agonistM617in rats with morphine tolerance[J].Neurosci Lett,2013,550:125-128.
[4]Arora Pandit M,Saxena RN.Galanin stimulates hCG inducedtesticular steroidogenesis in adult but not in immature malerats[J].Indian J Exp Biol,2007,45(4):333-337.
[5]Kuteeva E,H?kfelt T,Wardi T,et al.Galanin,galanin recep-tor subtypes and depression-like behaviour[J].EXS,2010,102:163-181.
[6]Gvilia I.Underlying brain mechanisms that regulate sleep-wakefulness cycles[J].Int Rev Neurobiol,2010,93:1-21.
[7]Pandit MA,Saxena RN.Galanin regulation of LH release inmale rats[J].Indian J Exp Biol,2010,48(6):544-548.
[8]Gutzler SJ,Karom M,Erwin WD,et al.Seasonal regulation ofsocial communication by photoperiod and testosterone:effectsof arginine-vasopressin,serotonin and galanin in the medialpreoptic area-anterior hypothalamus[J].Behav Brain Res.2011;216(1):214-219.
[9]Lawrence CB,Fraley GS.Galanin-like peptide:neural regula-tor of energy homeostasis and reproduction[J].EXS.2010;102:263-280.
