多环芳烃的2种单克隆抗体及其免疫学特性

　　多 环 芳 烃 （polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）是指由 2 个以上芳香环构成的化合物，主要由煤、石油等有机物的不完全燃烧产生。 飞机、汽车尾气、城市排放的生活污水及工业废水，甚至是油炸、熏制食品及食品包装材料、玩具、轮胎等塑料橡胶制品中都含有大量的 PAHs[1-2]. 环境中许多种类的 PAHs及其代谢物对人类具有潜在的、持续的毒害作用[3-4].美国和欧盟分别将不同种类的 PAHs 规定为优先控制污染物并规定了限量要求[5-6],我国也颁布了国家标准严格限制饮用水、空气、食品中苯并（a）芘的含量[7-9].

　　目前，PAHs 定量检测最常用的方法是气相色谱-质谱连 用法（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）和高效液相色谱法 （high performance liquidchromatography, HPLC），这类方法样品前处理步骤繁琐，检测时间长，很难满足大量样品的快速筛查和检测要求[10-11]. 国外很早就开始研究 PAHs 的免疫学检测方法，并建立了 PAHs 酶联免疫吸附（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA） 分析方法 , 研究表明 ,ELISA 方法灵敏度高，操作简便，可与仪器分析方法联合应用，适合对大量样品的快速筛选，实现 PAHs的现场监控[12-17]. 此前，国内也有少量的关于 PAHs 酶联免疫方法的研究报道，但多采用多克隆抗体。 杨丽波等制备了抗萘多克隆抗体，建立了测定水中萘的ELISA 检测方法[18]. 张彦峰等利用自制的多抗血清以间接竞争ELISA法，测定芘的IC50值为0.132mg/L,检出限为 0.1 mg/L,但并没有对抗血清进行纯化，进一步优化建立完善的检测方法[19].

　　本研究在前期成功制备了抗多环芳烃多克隆抗体的基础上[20],制备了针对 PAHs 的 2 种单克隆抗体，并对其免疫学特性进行了研究，以期用于不同种类的 PAHs ELISA 检测试剂盒的研制。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂 Infinite M200 酶标仪 （TECAN），倒置显微镜（Olympus）。 USEPA 优先控制的 16 种 PAHs标准品购自百灵威公司。 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG（IgG-HRP）购自 Jackson 公司。 弗氏不完全佐剂 、弗氏 完 全 佐 剂 、牛 血 清 白 蛋 白（bovine serumalbumin,BSA）、HAT 培养基 、3,3′，5,5′- 四甲基联苯胺（3,3′，5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB）购自于Sigma 公司。 PEG1500 为 Roche 公司产品；DMEM 培养基为 Gibco 公司产品；BCA 蛋白测定试剂盒由上海生工生产；抗体亚类测定试剂盒为 Southernbiotech（SBA）生产；Balb/c 雌性小鼠购于北京实验动物研究中心。

　　1.2 人 工 抗 原 的 制 备 和 鉴 定 以 芘 丁 酸 （1 -pyrenebutyrate, PBA）为半抗原 ,采用活性酯法分别与 BSA 和 OVA 偶联合成免疫抗原和包被抗原，具体方法参见文献[20].

　　1.3 动物免疫 取 6~8 周龄雌性 Balb/c 小鼠，内眦取血，分离血清，作为阴性血清。 以 PBA-BSA（60 μg）与弗氏完全佐剂混合后，腹腔免疫。 2 周后，以 PBA-BSA（30 μg）加弗氏不完全佐剂再次腹腔免疫。 此后，每隔 2 周以 PBA-BSA（30 μg）加弗氏不完全佐剂强化免疫。 第 4 次免疫后 2 周，内眦取血，分离血清，以PBA-OVA 为包被抗原，间接 ELISA 检测血清中抗体效价。 选择抗体效价高的小鼠，以 PBA-BSA（50 μg）脾内加强免疫，3~4 d 后取其脾细胞做细胞融合。

　　1.4 细胞融合 将对数生长期的 Sp2/0 细胞与小鼠脾细胞按 1∶5 的比例混合，1 500 r/min 离心 5 min. 弃上清，轻弹管底使细胞充分散开。将离心管放入 37 ℃水浴中，1 min 内缓慢加入 1 ml 的 50% PEG,静置 1 min,然后缓慢加入 2 ml 的无血清的 DMEM,1 500 r/min离心 5 min,弃上清，加入含 20%小牛血清的 HAT 选择培养基，混匀后，接种于含有饲养细胞的 96 孔培养板中，置 37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

　　1.5 杂交瘤细胞株的筛选与克隆 融合约 10 d 后，分别以 2 μg/ml“PBA-OVA”和“BSA”包被酶标板，间接ELISA 法检测杂交瘤细胞的上清液。有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化，扩大培养后，竞争 ELISA方法筛选分泌抗 PAHs 的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

　　1.6 单克隆抗体的制备及纯化 采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体， 将腹水 5 000 r/min 离心 20 min除去细胞和其它沉淀物，硫酸铵-正辛酸初步纯化后，采用 Protein G 亲和层析的方法进一步纯化。 BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量，SDS-PAGE 鉴定抗体纯度。

　　1.7 抗体亚类测定 抗体亚类试剂盒检测单克隆抗体亚类。

　　1.8 抗体亲和常数测定 采用间接 ELISA 方法测定抗体效价和亲和常数[21]. 以 “PBA-OVA”抗原按照2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg/ml 包被酶标板，将单抗从200 倍开始倍比稀释，以抗体质量浓度（mg/ml）的对数值为横坐标，以其相对应的吸光度 A 值为纵坐标，绘制反应曲线。 找出各条曲线的 Amax和 50% Amax所对应的抗体质量浓度，根据式（1-1）计算出该株单抗的亲和常数 Ka:Ka=（n-1）/2（n[Ab′]t-[Ab]t） （1-1）式中： n 为每组中 2 个包被浓度的倍数；[Ab′] t 和[Ab] t分别为每组中 2 个 50% Amax所对应的抗体质量浓度。

　　1.9 抗 体 特 异 性 与 交 叉 反 应 率 测 定 以 2 μg/mlPBA-OVA 为包被抗原，用 0.01 mol/L PBS 缓冲液将PBA 稀释成不同质量浓度的标准溶液做为竞争抗原，竞争 ELISA 检测抗体的特异性。 酶标仪双波长（450 nm,630 nm）测定吸光度（A），按照式（1-2）计算不同浓度 PBA 对抗原抗体结合反应的抑制率：IC=[1-（A样品-A空白）/（A0-A空白）]×100 （1-2）式中：IC-待测物对抗原抗体反应的抑制率（%）；A样品-待测物标准液的平均 A 值；A0-待测物标准液浓度为 0 时的平均 A 值；A空白-不加入二抗及待测物标准液的平均 A 值。 以标准溶液浓度的对数值为横坐标，抑制率 IC 为纵坐标绘制标准曲线。

　　PAHs 的种类在 100 种以上，本文以 USEPA 列出的水质中优先控制的 16 种多环芳烃为研究对象代替 PBA 按照上述方法测定各类 PAHs 的抑制中浓度 （IC50），以芘 IC50为参照，计算每种 PAHs IC50值与芘 IC50比值即为每种物质的交叉反应率（CR%），从而确定单克隆抗体对不同种类 PAHs 的交叉反应。