多环芳烃的2种单克隆抗体及其免疫学特性(2)

　　2.1 小鼠免疫效果测定 间接 ELISA 结果显示，经过4 次免疫后，1、3、4 号小鼠的血清中抗体的效价为均1∶（2.56×104），2 号小鼠效价为 1∶（1.28×104），表明该免疫方案可行。

　　2.2 细胞融合及杂交瘤细胞株的建立 融合后的细胞经含 HAT 选择培养基培养后，在 465 孔融合细胞中，共有 14 株抗体分泌阳性，阳性率仅为 3% （14/465）。 2~3 次克隆化后获得 2 株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 #1 和 #6-B7. 经多次传代、冻存及复苏，2 株细胞株都能稳定分泌抗体。

　　2.3 单克隆抗体的纯化及亚类测定 纯化的单克隆抗体纯度检测结果见图 1,20 倍稀释的未纯化腹水SDS-PAGE 结果为多条带，Protein G 亲和纯化后得到的抗体重、轻链相对分子质量约为 55 000 和 23 000,无杂带，说明抗体纯化效果较好。 纯化后，2 种单克隆 抗 体 的 蛋 白 质 质 量 浓 度 分 别 为 4.1 mg/ml 和3.6 mg/ml. 2 株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体亚类均为 IgG1.

　　2.4 单克隆抗体效价和亲和常数测定 采用间接ELISA 方法测定 #1 抗体效价为 25 600,亲和常数为7.52×108;#6-B7 抗体的效价为 51 200 , 亲和常数为1.25×109, 如图 2 所示，2 株抗体均为高亲和力的抗体。2.5 单克隆抗体特异性及交叉反应结果 采用竞争ELISA 方法鉴定 2 株抗体，标准曲线如图 3 所示，结果表明 2 株细胞株分泌的抗体都对 PBA 有明显的竞争反应。 对 PBA 的 IC50值分别为（#1）0.016 mg/L 和（#6-B7）0.006 8 mg/L,此结果低于张彦峰等[19]制备的多抗血清对 PBA 的 IC50值，说明以上 2 株抗体对PBA 的灵敏度更高。 表 1 中交叉反应结果表明，mAb#1 和 mAb #6-B7 不仅特异的针对 PBA,而且分别对表 1 中 7 种和 6 种 PAHs 的交叉反应率在 10%以上，且均为四环以上 PAHs,说明 2 株单克隆抗体都对高环的 PAHs 较为敏感，以上结果与本研究组之前所做多克隆抗体的交叉反应结果相近[20]. 由此可以推断出，以高环 PAHs 半抗原免疫实验动物产生的单克隆抗体或多克隆抗体都与低环的 PAHs 的交叉反应较低甚至无法识别。 mAb #1 对苯并（a）芘的 IC50为0.026 mg/L,CR 值为 103 8.5%, 灵敏度明显高于芘，推测可能是由于芘和苯并（a）芘结构与芘丁酸相近，而苯并（a）芘多出的苯环比失去支链后的芘更有利于抗体的识别。

　　3 讨论

　　本研究采用自制的 PBA-BSA 作为人工免疫抗原，成功免疫小鼠，通过细胞融合技术获得 2 株产生抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株 #1、#6-B7.经多次传代、冻存与复苏，这 2 种杂交瘤细胞株均能稳定分泌抗体，2 株抗体均具有效价高、亲和力强的特点。 2 株抗体均于多种 PAHs 存在交叉反应，此结果与张彦峰等[19]同样以 PBA-BSA 为抗原制备多抗血清的不同，无论是本文中的 2 株单克隆抗体还是之前所做的多克隆抗体[20],都与高环 PAHs 具有较高的交叉反应，而对低环 PAHs 灵敏度低甚至无法识别。 在实际环境中，PAHs 常以多种混合物的形式存在，可利用 ELISA 方法的交叉反应对环境样品中高环PAHs 含量进行初步筛查。 而单克隆抗体与多克隆抗体相比稳定性好， 批间变异小更适合开发 ELISA 试剂盒使用。 同时，通过 IC50值比较发现 #1 对苯并（a）芘的识别能力更强，可以进一步优化 ELISA 的条件，提高灵敏度，建立可以检测苯并（a）芘 ELISA 方法，从而开发出检测环境中苯并（a）芘 ELISA 试剂盒。

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