摘 要： 目的 ：通过去除和不去除眶下神经外膜焦点堆迭的对比及H-E染色，研究大鼠眶下神经微血管解剖结构特点。方法 ：10%水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠，开胸插管后依次用0.9%氯化钠和4%多聚甲醛灌流，再用37℃5%明胶-墨汁混合液灌注，解剖游离眶下神经，将去除和未去除神经外膜的眶下神经制成透明标本后获取不同焦距层面照片进行焦点堆迭，石蜡包埋后，切片行H-E染色，观察大鼠眶下神经微血管的分支、分布及走行特点。结果 ：大鼠眶下神经外膜染色呈大片区域的深染，近心端染色更深。去除神经外膜的眶下神经微血管清晰度高。眶下神经微血管的数量众多、密度大、染色深，近心端管径较大，微血管在不同层面发出的分支吻合形成微血管网。在神经纤维之间分布较多管径较小的微血管，多沿神经纤维纵向迂曲走行，在走行过程中可斜向或纵向发出分支吻合成网。结论：SD大鼠眶下神经微血管数量多、密度大，在迂曲走行过程中发出分支并吻合成网状。
关键词： 眶下神经; 微血管; 解剖; 大鼠;
Abstract： Objective : To study the anatomical features of the infraorbital nerve microvessels in SD rats by HE staining and compare focus stacked images with or without removal of infraorbital epineurium. Methods : The SD rats were anesthetized with 10% chloral hydrate by intraperitoneal injection. Cardiovascular system was perfused with saline, 4% paraformaldehyde and 5% gelatin-ink at 37℃ in order. The free infraorbital nerve in rats was dissected. The infraorbital nerves with and without removal of the epicardium were made into transparent specimens, and photos of different focal planes were taken for focus stacking. The paraffin-embedded sections were stained with H-E to observe the branches, distribution and running characteristics of the infraorbital nerve microvessels. Results : The infraorbital nerve epithelium of SD rats was stained in a large area and stained deeper at the proximal end. The infraorbital nerve microvessels without the epicardium was of high clarity. There were numerous microvessels in the infraorbital nerve of SD rats, the density was high, the staining was deep, the diameter of the proximal end was larger, and the branches of the microvessels at different levels formed a microvascular network. There were many microvessels with smaller diameters between the nerve fibers, which were mostly twisted along the longitudinal direction of nerve fibers. The microvessels could be branched or meshed obliquely or longitudinally during the running process. Conclusion : The SD rats have a large number of suborbital nerve microvessels with a high density, and the microvessels branch out and anastomose into a network during the process of distortion.
Keyword： infraorbital nerve; microvessel; anatomy; rat;
眶下神经是三叉神经上颌神经的主要分支，位置表浅，便于操作，是建立三叉神经痛动物模型的主要手术对象[1]。三叉神经痛是指该神经所支配区域发生的阵发性疼痛，其发病机制尚不完全清楚，目前比较公认且有显微解剖学依据的是局部微血管压迫学说。该学说认为血管压迫神经后可导致神经微循环障碍，进而引发脱髓鞘等一系列病理性改变，从而影响动作电位的传播[2]。已有学者对三叉神经受到微血管压迫和微血管减压术成功情况进行了研究[3,4,5,6,7,8]，但对三叉神经正常及受压后神经微血管的具体分布特点仍不清楚，且尚未见有关眶下神经微血管的研究报道。本实验主要研究SD大鼠眶下神经微血管的分支、分布及走行等解剖结构特点，充实了解剖学数据资料，为三叉神经痛发病机制的研究提供解剖学依据。
1、 材料和方法
1.1 、实验动物
SD大鼠10只，体质量200～210 g，购于大连医科大学SPF实验动物中心，雄性。
1.2 、主要实验试剂及软件
明胶（上海国药集团化学试剂有限公司）；一得阁墨汁（北京）；H-E染液；体视显微镜（Olympus SZ2-ST）；组织切片机（Leica RM2235）；光学显微镜（Olympus BX43）；焦点堆迭软件（Zerene Stacker 1.04）。
1.3 、灌注、取材及切片
10%水合氯醛腹腔内注射麻醉SD大鼠，开胸暴露心，左心室插管，右心耳放血后，快速灌注0.9%NaCl溶液，再行4%多聚甲醛溶液灌注，最后用过滤的37℃5%明胶-墨汁混合液灌注至大鼠眼结膜、口唇及全身皮肤变黑为止。结扎肺动脉，肺静脉，上、下腔静脉和主动脉弓，-4℃冷冻15 min。在体视显微镜下解剖游离眶下神经，截取眶下神经出眶下孔后约2 mm的一段，放入4%多聚甲醛固定液内固定24 h，蒸馏水冲洗10 min。体视显微镜下去除5只SD大鼠眶下神经的外膜，另5只保留神经外膜，两者均经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后制成明胶-墨汁灌注透明标本，体视显微镜下观察，并进行不同焦距层面的拍照。将去除眶下神经外膜的透明标本经无水乙醇去除二甲苯后行石蜡包埋，纵向切片（厚10μm),60℃烤片3 h，经脱蜡、水化、H-E染色、二甲苯透明和中性树胶封片后，在光学显微镜下观察并进行拍照。
1.4、 图像及切片处理
将体视显微镜下获取的不同焦距层面的图像导入Zerene Stacker软件中进行焦点堆迭。经H-E染色的切片，光学显微镜下放大400倍拍照。
2 、结果
2.1 、眶下神经焦点堆迭
在体视显微镜下，将2只SD大鼠眶下神经放大40倍，每只每侧各获取不同焦距层面的图像25张，将每侧图像分别进行焦点堆迭后各获得1张图像。未去除神经外膜的SD大鼠眶下神经部分不同焦距层面的图像能较清晰显示该层面部分微血管的分支、分布及走行（图1A～E），另有部分区域因聚焦原因和被神经外膜及其他层面的组织遮挡显得模糊。焦点堆迭后的图像能较清晰显示眶下神经不同层面全部区域微血管的分支、分布及走行（图1F）。去除神经外膜的SD大鼠眶下神经部分不同焦距层面的图像能清晰显示该层面部分微血管的分支、分布及走行（图2A～E），也另有部分区域因聚焦原因和被其他层面的组织遮挡显得模糊。焦点堆迭后的图像能清晰显示眶下神经不同层面全部区域微血管的分支、分布及走行（图2F）。两者相比图1比图2染色深，微血管的清晰度差；图2染色浅，但微血管的清晰度好。眶下神经微血管的数量众多，微血管的密度大，染色深，近心端的微血管管径比远心端的微血管管径大，微血管走行迂曲，在不同的层面发出分支并不断吻合成网，然后沿神经纤维方向分支顺行，密度随之降低，染色变浅。眶下神经外膜染色呈大片区域的深染，近心端染色更深一些（图1），去除神经外膜后能较清晰显示神经内微血管的解剖结构（图2）。
图1 SD大鼠左侧未去除神经外膜的眶下神经不同焦距层面及焦点堆迭图像，×40
Fig 1 Image of left infraorbital nerve at different focal levels and after focus stacking in SD rats with the epineurium not being removed，×40
A-E:The image of different layers;F:The image after focus stacking
图2 SD大鼠左侧去除神经外膜的眶下神经不同焦距层面及焦点堆迭图像，×40
Fig 2 Image of left infraorbital nerve at different focal levels and after focus stacking in SD rats with the epineurium being removed，×40
A-E:The image of different layers;F:The image after focus stacking
2.2 、眶下神经H-E染色
将SD大鼠眶下神经石蜡标本纵向切片后行H-E染色，镜下放大400倍后拍照（图3）。在眶下神经纤维之间分布着较多的微血管，微血管管径较小，密度较大，微血管多沿神经纤维纵向迂曲走行，在走行过程中可斜向或纵向发出分支，吻合成网。
图3 SD大鼠眶下神经切片H-E染色，×400
Fig 3 H-E staining of infraorbital nerve in SD rats，×400
3 、讨论
目前，有关三叉神经痛发病机制的研究结果表明，神经受压迫致使神经微循环障碍，从而导致神经脱髓鞘变而产生神经痛的周围学说占主流[9,10,11,12]。眶下神经是三叉神经的分支上颌神经在面部的1个终末分支，研究大鼠眶下神经微血管的分支、分布及走行解剖特点，可为探究眶下神经的血液供应及微循环和三叉神经痛的发病机制提供参考。大鼠的三叉神经与人三叉神经的解剖结构有所不同，大鼠的三叉神经节发出上颌神经-眼神经干和下颌神经2个分支，即上颌神经和眼神经共干。神经干的远段穿行颅底骨的骨管内，到达眶尖后方后分为眼神经和眶下神经，眶下神经经眶脂体内下方，紧靠眶内侧壁，穿过眶下神经沟出眶，分布于触须垫[13]。
焦点堆迭是在同一背景上将多张不同焦点的照片对焦点进行拼接成1幅照片[14]。本研究每只每侧眶下神经共获取不同焦距层面的图像25张，进行焦点堆迭后各合成1张图像，未去除神经外膜的眶下神经焦点堆迭的图像较能清晰显示大鼠眶下神经微血管的分支、分布及走向，但没有去除神经外膜的眶下神经焦点堆迭的图像显得清晰。眶下神经外膜的染色呈深染的大片区域，近心端的染色更深一些，提示近心端的血管密度更大一些，有局部区域呈墨浸状可能是由于神经外膜表面上其他组织没有去除干净造成组织重叠。图片中出现的空泡是由于神经透明标本较厚和切片封片时混入了空气所致。眶下神经微血管的数量多、密度大、染色深，近心端微血管管径比远心端微血管管径大，微血管迂曲走行，并在不同的层面发出分支，不断吻合成网，沿神经纤维方向分支顺行，密度随之降低，染色变浅。微血管吻合成网有助于更好为神经纤维提供全方位的营养，沿神经纤维走行方向迂曲顺行，则有助于在面部肌肉等软组织发生位移时为神经提供营养。已有研究利用焦点堆迭技术进行了正常大鼠三叉神经节内微血管解剖结构特点和大鼠三叉神经痛模型神经微循环变化的研究，研究结果表明，此技术能较好显示正常大鼠三叉神经节内微血管的解剖结构特点和三叉神经痛模型神经微循环随着时间推移而发生的变化[15,16,17]。
本研究用过滤的37℃5%明胶-墨汁混合液灌注SD大鼠，游离其眶下神经出眶下孔后约2 mm的一小段，经石蜡包埋纵向切片后行H-E染色。去除神经外膜虽能够消除神经外膜层面组织结构对神经内部成像清晰度的影响，但能够增加在切片和展片过程中神经纤维之间分离的危险度，尤其是在顺神经纤维纵向切片时。明胶-墨汁灌注能较好显示血管，尤其是微血管，因此经常用于研究微循环，但应注意明胶和墨汁的配比，明胶占比过大会增加混合液的黏稠度，不利于完全灌注到微血管中，明胶占比过小则会增加混合液的流动性，不利于混合液停留在微血管中[18,19]。此外还要注意明胶-墨汁混合液的温度要适宜，本研究采用37℃。H-E染色能较好显示神经元胞体和神经纤维，将H-E染色与明胶-墨汁灌注结合起来就能显示神经与血管的关系，神经微血管的分支、分布及走行规律[20]。在神经纤维之间分布着较多的微血管，管径较小，密度较大，微血管多沿神经纤维纵向迂曲走行，在走行过程中可斜向或纵向发出分支吻合成网，能够更好为神经纤维提供营养，使神经适应不同的状态发挥相应的功能。
综上所述，通过明胶-墨汁灌注、焦点堆迭和H-E染色能够研究大鼠眶下神经微血管的解剖结构特点。SD大鼠眶下神经微血管数量多、密度大，在迂曲走行过程中发出分支并吻合成网状。
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