基于小鼠模型探析哮喘的发病机制

　　[摘要] 目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/ 真核生物始动因子 4E 结合蛋白 1（4EBP1）/ 缺氧诱导因子 -1α（HIF-1α）/ 血管内皮生长因子（VEGF）信号通路在哮喘小鼠中的表达及意义。方法 40只 SPF 级 6~8 周龄雌性 Balb/c 小鼠随机分为对照组、哮喘组、布地奈德干预组及 mTOR 抑制剂（雷帕霉素）干预组，每组 10 只。卵清蛋白致敏激发建立哮喘小鼠模型，各干预组分别在激发前 30 min 给予雷帕霉素 3 mg/kg腹腔注射或布地奈德混悬液 1 mg 雾化吸入，对照组和哮喘组以生理盐水代替。于末次激发 24 h 后处死小鼠，收集肺泡灌洗液（BALF），采用 ELISA 法测定 HIF-1α、VEGF 水平；取肺组织行苏木精 - 伊红（HE）染色观察其病理变化；免疫组化染色和 Western blot 法测定肺组织磷酸化的 mTOR 及 4EBP1（p-mTOR 及 p-4EBP1）蛋白表达水平。Pearson 法分析 p-mTOR、p-4EBP1、HIF-1α、VEGF 表达的相关性。结果 与对照组相比，哮喘组气管及其周围炎性细胞浸润明显，分泌物增多；BALF 中 HIF-1α、VEGF 水平显着升高（P<0.01）；肺组织 p-mTOR、p-4EBP1 表达显着增加（P<0.01）。与哮喘组相比，各干预组气道炎症浸润明显减轻，分泌物减少；BALF 中 HIF-1α、VEGF 水平明显下降（P<0.01）；肺组织 p-mTOR、p-4EBP1 表达显着降低（P<0.01）。对照组及两干预组间相比上述指标变化差异均无统计学意义（P>0.05）。哮喘组小鼠 p-mTOR、p-4EBP1、HIF-1α、VEGF 表达水平两两互呈正相关（P<0.05），而对照组及两干预组各指标间无相关性（P>0.05）。结论 哮喘发生时 p-mTOR、p-4EBP1、HIF-1α、VEGF 可能协同参与了哮喘的发病过程。雷帕霉素能阻断这一过程，可能作为治疗哮喘的新靶点。 [中国当代儿科杂志，2017,19（1）：104-110]
　　
　　[关键词] 哮喘；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；真核生物始动因子 4E 结合蛋白 1;缺氧诱导因子 -1α；血管内皮生长因子；小鼠。
　　
　　Abstract: Objective To study the expression and significance of the mammalian target of rapamycin （mTOR）/eukaryote initiating factor 4E binding protein 1（4EBP1）/hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）/vascular endothelialgrowth factor （VEGF） signaling pathway in asthmatic mice. Methods Forty SPF level 6-8 week-old female Balb/C mice were randomly divided into control, asthma, budesonide and mTOR inhibitor （rapamycin） intervention groups（n=10 each）。 The asthmatic mouse model was prepared via OVA induction and challenge test. The intervention groupswere administered with rapamycin at the dosage of 3 mg/kg by an intraperitoneal injection or budesonide suspensionat the dosage of l mg by aerosol inhalation respectively 30 minutes before the OVA challenge. The control and asthmagroups were treated with normal saline instead. The concentrations of HIF-1α and VEGF in bronchoalveolar lavagefluid （BALF） were examined using ELISA 24 hours after the last challenge. The pathological changes of lung tissuewere observed by hematoxylin-eosin （HE） staining. The p-mTOR and p-4EBP1 from the lung tissues were detected byimmunohistochemistry and Western blot. Pearson analysis was used to study the correlation between p-mTOR, p-4EBP1,HIF-1α， and VEGF expression. Results Compared with the control group, inflammatory cell infiltration and secretionsin the trachea increased in the asthma group. The levels of HIF-1α and VEGF in BALF and p-mTOR and p-4EBP1expression in lung tissues also increased （P<0.01）。 Compared with the asthma group, inflammatory cell infiltration andsecretions in the trachea were reduced in the two intervention groups, and the levels of HIF-1α and VEGF in BALF andp-mTOR and p-4EBP1 expression in lung tissues were also reduced （P<0.01）。 There were no significant differences inthe above changes between the two intervention groups and control group （P>0.05）。 In the asthma group, there was apairwise positive correlation between lung p-mTOR and p-4EBP1 expression and HIF-1α and VEGF levels in BALF（P<0.05）。 However, there were no correlations in the above indexes in the intervention groups and control group.Conclusions p-mTOR, p-4EBP1, HIF-1α and VEGF together are involved in the pathogenesis of asthma. Rapamycintreatment can block this signaling pathway, suggesting that this pathway can be used as a novel target for asthmatreatment. [Chin J Contemp Pediatr, 2017, 19（1）：104-110]
　　
　　Key words: Asthma; Mammalian target of rapamycin; Eukaryote initiating factor 4E binding protein 1; Hypoxiainducible factor-1α； Vascular endothelial growth factor; Mice.
　　
　　哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞及多种细胞因子等共同作用，以气道慢性炎症浸润、气道重塑及可逆性气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病[1],至今发病机制并不完全清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是一种高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶，由于处于生长调节的中心环节而倍受关注 , 在炎症损伤、免疫应答及肿瘤等方面发挥重要作用[2-3].研究发现 mTOR 高表达也同样存在于哮喘中，这可能因为 mTOR 参与了哮喘气道炎症浸润及气道重塑等病理过程[4],而 mTOR 抑制剂雷帕霉素能阻断这一过程抑制哮喘的发生，但 mTOR 是如何通过下游靶蛋白参与哮喘的发生少见相关报道。真核生物始动因子 4E 结合蛋白 1（eukaryote initiatingfactor 4E binding protein 1, 4EBP1）是 mTOR 下游的一个重要靶蛋白，激活后可促进包括缺氧诱导因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在内的调节细胞生长关键蛋白的翻译[5],研究发现 HIF-1α 及 VEGF 在哮喘发生中发挥重要作用[6-8],由此我们推测 mTOR 可能通过激活4EBP1 从而引起 HIF-1α 及 VEGF 表达增加促进哮喘发生，而磷酸化的mTOR、4EBP1（即 p-mTOR、p-4EBP1）被认为是该信号通路激活的标志，本研究通过建立小鼠哮喘模型，检测肺组织 p-mTOR、p-4EBP1及肺泡灌洗液中HIF-1α、VEGF的表达，从而进一步明确哮喘的发病机制，寻找有效治疗哮喘的新方法。
　　
　　1 材料与方法。
　　
　　1.1 实验动物与试剂。
　　
　　SPF 级 6~8 周龄雌性 Balb/c 小鼠 40 只，体重为18~22 g,由河南省动物实验中心提供。p-mTOR、p-4EBP1 抗体（美国 Santa Cruz 公司），雷帕霉素、卵清蛋白（OVA）（美国 Sigma 公司）。
　　
　　1.2 动物模型制备与分组。