正畸治疗中牙龈炎性反应是固定矫治过程中的常见并发症，牙龈炎症的发生与诸多因素有关，牙周致病菌是重要因素之一。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)是目前公认的慢性牙周炎的主要致病菌之一，能分泌大量的毒力因子，导致牙周组织破坏，在牙周病的发生、发展中起重要作用。致病岛的发现使人们对细菌致病性有更深的认识。目前rag位点被确定为P.g的致病岛基因之一，研究证实，rag位点失活会使P.g的致病性降低，对牙周组织的破坏减少。rag位点在临床菌株中有4种基因型，分别命名为rag-1、rag-2、rag-3和rag-4，不同基因型的致病能力亦不同。本研究采用16SrDNAPCＲ和多重PCＲ对P.g及致病岛rag基因进行检测，分析其与临床指标的关系，探讨P.g及致病岛rag基因在正畸牙龈炎性反应中的作用。
资料和方法
1.材料
牙龈卟啉单胞菌P.g(ATCC33277)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，F.n)(ATCC25586)和伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，A.a)(ATCC29522)(购自四川大学华西口腔医学院);牙龈卟啉单胞菌(W83)(购自北京口腔医院);细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。
2.临床资料
选取102名受试者(济南市口腔医院正畸科和口腔内科)。所有受试者3个月内未接受系统牙周治疗，未服用抗生素和引起牙龈增生的药物。
牙周检查:对全口牙牙龈指数(Gingivitisindex，GI)、探诊深度(probingdepth，PD)进行普查，选临床症状最重的1颗牙为受试牙记录指数。按照LoeH和Silness1967年修定的标准，分别记录受试牙牙龈近中、远中、颊侧、舌侧4个区域的牙周情况，以4个牙面记分的平均值记录为牙龈指数。GI分级标准为:0为牙龈正常;1为牙龈轻度炎症，轻度颜色改变、轻度水肿、探诊不出血;2为牙龈中度炎症，颜色发红，水肿光亮、探诊出血;3为牙龈重度炎症;明显发红和水肿、或有溃疡、有自发出血倾向。由统一受过训练的医师对受试者进行临床检查和标本收集。
纳入标准:正畸牙龈炎组:戴入矫治器后产生牙龈炎性反应者(GI≥1，PD≥3mm)57例，男19例，女38例，年龄10～30岁，平均16.30岁;对照组:戴矫治器前牙周健康者(GI=0，PD＜3mm)20例，男8例，女12例，年龄10～30岁，平均16.05岁;牙周炎组:牙周科确诊的牙周炎患者(GI≥1，PD＞4mm)25例，男性15例，女性10例，年龄20～60岁，平均40.36岁。
3.实验方法
由统一培训过的医师对患者进行牙周检查;采用无菌纸尖法采集患者牙周袋或龈沟中的龈沟液。标本采集选患者炎症最严重的患牙，取其牙周探诊最深部位;常规清水漱口，生理盐水冲洗，去除食物残渣，棉球隔湿，吹干，将无菌纸尖插入牙周袋或龈沟有阻力时停止，停留30s取出，放入1ml磷酸盐缓冲液的EP管内，-20℃保存待测。
标准菌株及龈沟液DNA提取:标准菌株DNA提取采用DNA提取试剂盒;临床标本DNA提取采用加热裂解法。引物设计及合成:P.g16SrDNA及4种rag基因型特异性引物序列的设计(表1)。
PCＲ扩增:16SrDNAPCＲ反应体系为PCＲ混合液12.5μL，模板DNA为标准株1.0μL(100ng/μL)，临床标本5.0μL，引物各1.0μL(10μM)，用无菌双蒸水补充至总体积25μL。
多重PCＲ反应体系:10倍反应缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，dNTPs0.5μL，模板DNA5.0μL，引物2.0μL(将未经稀释的5对引物的原始液混合稀释后的引物作为应用液，计作引物A，将4种rag基因型的引物混合稀释后的引物计作引物B)，用无菌双蒸水补充至总体积25μL。
PCＲ循环条件:94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min(30个循环);72℃延伸10min。16SrDNAPCＲ与多重PCＲ对标准株的检测:以16SrDNA引物扩增P.g2个标准菌株(ATCC33277和W83)，以F.n和A.a为阴性对照，以无菌双蒸水为空白对照，检测引物对P.g的特异性和敏感性。
分别以16SrDNA、混合引物A、混合引物B为引物，以P.gATCC33277的DNA为模板，进行多重PCＲ扩增，检测多重PCＲ的敏感性及引物的特异性。
16SrDNAPCＲ及多重PCＲ对临床标本的检测:以16SrDNA为引物，以临床标本DNA为模板，对临床标本进行检测，确定P.g阳性患者;以P.g阳性患者DNA为模板，以混合引物B为引物进行多重PCＲ扩增，确定致病岛rag基因的分布情况。
PCＲ扩增产物检测:取扩增产物，用1×TAE电泳缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5mg/L溴化乙锭)，电泳条件为电压90V，时间15～20min，凝胶成像分析。
4.统计学分析
采用SPSS13.0统计软件，组间P.g及致病岛rag基因检出率的差异用χ2检验;P.g及致病岛rag基因检出率与患者年龄及临床指数的差异用独立样本的t检验;细菌检出率与各级临床指标之间的关系用Spearman等级相关分析。
结果1.16SrDNAPCＲ与多重PCＲ对标准株的检测结果琼脂糖凝胶电泳结果可见，应用16SrDNAPCＲ技术，P.gATCC33277和P.gW83菌株DNA均扩增出404bp的目的条带，而阴性对照A.a和F.n及空白对照未见目的条带，说明该引物具有扩增P.g的特异性，该反应体系具有检测P.g的敏感性(图1)。
应用多重PCＲ技术，以P.g菌株DNA为模板，16SrDNA引物扩增出404bp目的条带，引物B扩增出739bp目的条带，引物A扩增出404bp和739bp目的条带;说明多重PCＲ反应体系具有扩增P.g及致病岛rag基因的特异性和敏感性(图2)。
2.临床指标检查结果牙龈指数结果:正畸牙龈炎组0级:16例，1级20例，2级21例;对照组均为0级20例;牙周炎组0级10例，1级15例。探诊深度结果:正畸牙龈炎组(57例)平均探诊深度为4.137±1.087mm，对照组(20例)为1.882±0.235mm，牙周炎组(25例)为5.688±0.459mm。牙周炎组高于正畸牙龈炎组，两者均显著高于对照组(P＜0.05)。
3.16SrDNAPCＲ及多重PCＲ对临床标本检测结果以16SrDNA引物PCＲ扩增102例受试者临床标本，检出P.g情况见表2;正畸牙龈炎组明显高于对照组，牙周炎组高于正畸牙龈炎组和对照组，三者之间有显著性差异(χ2=15.918，P＜0.001)。PCＲ对正畸牙龈炎患者临床标本P.g检测结果见图3，a为标准P.g菌株阳性对照;b为空白对照;c～n为临床标本，其中除c、h外，均扩增出404bp目的条带。
以pn为引物PCＲ扩增65例P.g阳性患者临床标本，扩增出致病岛rag基因的有52例，结果见表2。正畸牙龈炎组明显高于对照组，牙周炎组高于正畸牙龈炎组和对照组，三者之间有显著性差异(χ2=30.630，P＜0.001)。多重PCＲ对正畸牙龈炎患者临床标本中致病岛rag基因的检测结果见图4，临床标本a、b均扩增出628bp目的条带，c扩增出979bp目的条带，d扩增出628bp和739bp目的条带，f扩增出739bp目的条带，e扩增出423bp目的条带，g未见目的条带。
4.P.g及致病岛rag基因检出率与GI之间的关系用Spearman等级相关分析P.g及致病岛rag基因检出率均与牙龈指数GI之间存在明显的正相关关系(P＜0.01)。65例PCＲ扩增阳性的患者平均年龄为25.54岁，而阴性的患者年龄平均为16.19岁，二者具有明显差异(t=3.922，P＜0.001)(表3)。
讨论
固定矫治是矫治错颌畸形的主要方法，但由于矫治装置的加入，使口腔微生态环境发生很大的变化，原有的微生态平衡状态被破坏，从而对口内定居的微生物产生影响，导致牙龈组织的炎症。P.g是革兰阴性专性厌氧菌，具有一系列逃避宿主防御机制及破坏宿主组织的毒性因子，如菌毛、多糖夹膜、脂多糖、外膜膜泡和多种蛋白酶，是目前公认的慢性牙周炎的重要病原菌，与牙周炎症的发生、发展和复发密切相关。本研究中的正畸牙龈炎组均为戴入矫治器之后产生牙龈炎性反应的患者，表现为牙龈肥大或增生，其平均年龄16.30岁，P.g的检出率为61.40%;作为对照组的为未带矫治器正畸治疗前的牙周健康者，其平均年龄为16.01岁，P.g的检出率为35.00%;而牙周炎组炎症最为严重，阳性率为92.00%，三者间有显著性差异。正畸牙龈炎组与对照组年龄相仿，但检出率却有明显差异，而且以Spearman等级相关分析正畸牙龈炎组P.g的检出率与GI呈显著的正相关关系，提示牙龈卟啉单胞菌不仅是慢性牙周炎的主要致病菌，对正畸矫治过程中产生的牙龈炎性反应也有重要作用。65例PCＲ扩增P.g阳性的患者平均年龄为25.54岁，而P.g阴性的患者年龄平均为16.19岁，二者具有明显差异，提示P.g的检出率可能随患者年龄的增加而增高。
病原菌致病是一个多因素共同作用的结果，P.g基因的多态性和复杂性使得其致病机制迄今尚不明了，致病岛的发现使人们对细菌致病性有了更深的认识。致病岛又称毒力岛，是伴随肠道致病菌的研究逐步被揭示的，致病岛是一个相对分子质量较大的片段，用于编码细菌毒力基因簇，是整合于细菌基因DNA组的外源性成分，推测其可能来自于细菌进化过程中DNA的基因水平转移事件。一种病原菌常常同时具有1个或几个致病岛，致病岛一般存在于强毒株中，弱毒株或无毒株常常缺失。目前，rag位点被确定是P.gingivalis的致病岛基因之一。rag位点主要含有基因ragA和ragB，分别编码ＲagA和ＲagB蛋白。ＲagA是TonB类受体外膜蛋白;而ＲagB是一种表面抗原，Ｒag蛋白构成膜转运系统，协助细菌从外部环境获取转运大分子，利于细菌的存活和散播;同时Ｒag蛋白还能够激活宿主的免疫及炎症反应。Curtis等用PCＲ技术分析ragB在龈下菌斑的分布，发现rag+的牙龈卟啉单胞菌在深牙周袋比在浅牙周袋位点更易检测到。研究说明rag基因可能影响牙龈卟啉单胞菌的潜在毒力。rag位点在临床菌株中有4种基因型，分别命名为rag-1、rag-2、rag-3和rag-4。在对四中rag基因型的比较中发现，它们的基因及氨基酸序列存在较大差异，这可能与基因转移及重组的过程中发生的大片段基因的获得和缺失从而产生的突变有关，四种ＲagB蛋白均为一种免疫抗原，它能够与宿主产生IgG免疫反应，但是它们彼此之间在结构及功能上的差异目前还没有实验证实。本研究采用多重PCＲ技术对临床标本中4种rag基因进行检测，所建立的多重PCＲ技术具有较高的敏感性和特异性，能够快速检测rag基因不同基因型的分布。本研究中P.g阳性患者临床标本，扩增出rag基因的阳性率正畸牙龈炎组明显高于对照组，牙周炎组高于正畸牙龈炎组和对照组，三者之间有显著性差异，说明P.g致病岛rag基因检出率与牙龈指数GI之间存在明显的正相关关系。
本研究表明，P.g致病岛rag基因与细菌致病性密切相关，在正畸治疗中牙龈炎性反应的发生发展可能起重要作用。致病岛rag基因不同基因型与牙周疾病之间的关系及在炎症发生发展中的具体作用机制还有待进一步研究。
