益生菌在人类营养学中被定义为对人类健康产生有益影响的食品补充物或者食品成分的活的微生物[1].虽然益生菌广泛用于胃肠疾病的防治，但是在口腔方面的研究还处于起步阶段。作为消化道的入口以及食物进入人体的必由之路的口腔具有复杂解剖结构和生理功能，构成了一个特殊的微生态系[2].随着对微生态平衡观点的接受，人们普遍认为龋病是微生态平衡受到破坏以后菌斑中的变形链球菌与底物作用产酸而致龋，所以通过调节微生态平衡防龋是现今众多学者们所追求的目标。双歧杆菌及其制剂是胃肠道疾病防治中使用最多的一种益生菌，同样作为口腔固有菌群中的一种，双歧杆菌具有在口腔中发挥益生作用的必要特性[3],所以许多口腔学者逐步开始探索双歧杆菌对口腔疾病的防治作用。许多国家在乳粉和饮料中添加双歧杆菌BB-12,我国自2007年也开始于乳制品中广泛添加双歧杆菌BB-12,但是关于其对胃肠道作用的研究较多，而对于口腔作用的研究尚属少数，并且多为国外学者的研究，国内尚缺乏关于双歧杆菌BB-12对于口腔作用研究的报道。所以本研究通过观察双歧杆菌BB-12对变形链球菌的拮抗作用，探讨不同因素对其抑菌效果的影响，为进一步研究双歧杆菌BB-12防龋提供实验依据。
1材料与方法。
1.1材料。
1.1.1实 验 菌 株变 形 链 球 菌 标 准 株ATCC25175,购自中国微生物菌种保藏中心；双歧杆菌BB-12,购自丹麦科汉森公司。
1.1.2培养基及试剂BHI液体培养基、BHI琼脂培养基，TPY液体培养基，TPY琼脂培养基、PBS缓冲液，购自广东环凯微生物技术有限公司。
1.1.3主要仪器和设备Olympus光学显微镜，恒温培养箱，厌氧袋及厌氧指示剂，高速低温冷冻离心机，紫外可见分光光度计。
1.2方法
1.2.1菌液制备变形链球菌复苏后接种于BHI琼脂培养基，经形态学和生化试验鉴定后，挑取单个菌落接种于BHI液体培养基中培养24h,传代3次后于4℃冰箱中保存备用。双歧杆菌BB-12在厌氧条件下复苏后接种于TPY琼脂培养基，经形态学和生化试验鉴定后，挑取单个菌落接种于TPY液体培养基中厌氧条件下培养24h,传代3次后于4℃冰箱中保存备用。
1.2.2双歧杆菌BB-12对变形链球菌的拮抗作用分别在3 000r/min下离心双歧杆菌BB-12与变形链球菌10min,使用pH=7的PBS缓冲液洗涤2次后悬浮于pH=7的PBS缓冲液中，使用紫外可见分光光度计调节600nm处的吸光度值为1.5,将A600nm=1.5的双歧杆菌BB-12与变形链球菌菌悬液按照体积比 （双歧杆菌体积/变形链球菌体积，以下简称体积比）为16/1、8/1、4/1、2/1、1/1、1/2、1/4、1/8和1/16组成2mL的混合溶液，震荡15s后立即观察摄像。37 ℃下静置培养10min后观察摄像。分别以A600nm=1.5的双歧杆菌BB-12和变形链球菌菌液为阴性对照。
1.2.3不同浓度下双歧杆菌BB-12对变形链球菌的拮抗作用按照上述方法分别制备A600nm=1.0和0.5的双歧杆菌BB-12与变形链球菌的菌悬液，按照体积 比 为16/1、8/1、4/1、2/1、1/1、1/2、1/4、1/8和1/16组成2mL的混合溶液，震荡15s后立即观察摄像。37℃下静置培养10min后观察摄像。
1.2.4不同pH下双歧杆菌BB-12对变形链球菌的拮抗作用分别在3 000r/min下离心双歧杆菌BB-12与变形链球菌10min,使用pH=5的PBS缓冲液洗涤2次后悬浮于pH=5的PBS缓冲液中，使用紫外可见分光光度计调节600nm处吸光度值为1.5,将A600nm=1.5的双歧杆菌BB-12与变形链球菌菌悬液按 照 体 积 比 为16/1、8/1、4/1、2/1、1/1、1/2、1/4、1/8和1/16组成2mL的混合溶液，震荡15s后立即观察摄像。37℃下静置培养10min后观察摄像。按照上述操作方法制备pH=6的双歧杆菌BB-12与变形链球菌菌悬液并按体积比混合观察。
1.2.5不同底物下双歧杆菌BB-12对变形链球菌的拮抗作用将传代后的BB-12菌液与变形链球菌菌液分别在300r/min下离心10min,使用pH=7的PBS洗涤2次后悬浮于2% pH=7的蔗糖溶液中，调A600nm=1.5置于37 ℃下孵育1h,按照体积 比 为16/1、8/1、4/1、2/1、1/1、1/2、1/4、1/8和1/16组成2mL的混合溶液，震荡15s后立即观察摄像。37℃下静置培养10min后观察摄像。按照上述操作方法观察2%pH=7的葡萄糖溶液对拮抗作用的影响。
1.2.6灭活双歧杆菌BB-12对变形链球菌的拮抗作用将传代后的双歧杆菌BB-12离心，使用pH=7的PBS缓冲液洗涤2次后悬浮于pH=7的PBS缓冲液中，调节A600nm=1.5,置于65℃下水浴30min灭活（使用TPY液体培养基检查活性已无），离心变形链球菌，洗涤2次，重悬于PBS缓冲液中，调节A600nm=1.5,按 体 积 比 混 合，震 荡15s后 置 于37℃下静置培养10min后观察。
1.2.7统计分析所有数据按照单因素方差分析Fisher检验，检验水准α=0.051.2.8扫描电镜下观察变形链球菌24h时生物膜的变化将准备好的无菌载玻片置于无菌培养皿中，分别向培养皿中加入10mL的BHI肉汤培养基，初始pH为7.0,按体积比为1∶10的比例将A600nm=1.5的变形链球菌1mL与A600nm=1.5的变形链球菌与双歧杆菌BB-12各0.5mL分别接种于，培养基中，37℃下培养24h,24h后取出载玻片，PBS缓冲液洗涤后放入2.5%的戊二醛4℃下固定过夜后分别用无菌PBS缓冲液与蒸馏水冲洗3次，随后依次使用20%、30%、50%、60%、70%、80%、95%和100%乙醇梯度脱水，干燥，喷金，于20 000倍下观察。
