2.4 重庆杜仲叶指纹图谱建立
2.4.1 试验材料
见附录表 2.36，2.37。
2.4.2 试验方法
2.4.2.1 检测波长的选择
取供试品溶液在 270-350nm 波长范围内进行检测，发现其色谱图在 280-310nm 波长范围内峰数多，故又分别比较了 280nm、285nm、290nm、295nm、300nm、310nm、328nm、340nm 波长处的谱图情况。结果见附录图 2.28 到 2.35。
2.4.2.2 测定方法
称取杜仲叶粉末若干份，每份 0.5g，放密闭反应器中，用 9mL30％乙醇溶液浸泡。记录总重量，70℃水浴加热 30min，放冷后过滤离心，30％乙醇补足减少的重量，微孔滤膜滤过，即得样品溶液。精密吸取杜仲叶提取液供试液各 15μl，按前述 HPLC 色谱条件进样检测，在 300nm 分别记录其色谱图。并将其导出*.AIA 格式，之后导入规定的相似度计算软件 。完成指纹图谱匹配及合成对照指纹图谱。
2.4.2.3 方法学考察
（1）精密度试验
精密称取粉碎好的杜仲叶药材粉末 0.5g，分别按上述 2.4.2.2 中方法制备待测提取液，重复进样 5 次，记录各自指纹图谱。通过分析处理，计算相对保留时间、峰面积的 RSD 值。
（2）重复性试验
精密称取 5 份粉碎好的杜仲叶药材粉末，分别按上述 2.4.2.2 中方法制备供试品溶液，依次记录各样品指纹图谱。数据导入及计算方法同精密度试验。
（3）稳定性试验
精密称取 5 份粉碎好的杜仲叶药材粉末，分别按上述 2.4.2.2 中方法制备待测溶液，依次在 0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h 取样记录测色谱图，数据导入及计算方法同精密度试验。
2.4.3 结果与分析
2.4.3.1 杜仲叶指纹图谱建立
杜仲叶药材色谱图共有成分峰的数据匹配图及对照指纹图谱见图 2.26 和图 2.27，杜仲叶绿原酸提取物 HPLC 色谱图见附录 2.36。
2.4.3.2 共有峰标定结果
（1）指纹图谱中的共有峰保留时间与相对保留时间结果在杜仲叶药材匹配色谱图中，以绿原酸成分峰作为参照峰，标定提取液色谱图共有峰的保留时间与相对保留时间。通过对 10 批杜仲提取液的数据分析，共标定 8 个共有峰，各指纹图谱中的共有峰的保留时间和相对保留时间结果见表 2.25，表 2.26。
由表 2.25，2.26 可知，10 批杜仲叶药材 HPLC 指纹图谱的共有峰有 8 个，以绿原酸保留时间为 1 的 8 个色谱峰的相对保留时间 RSD 值在 0.02％-0.13％之间，小于 3％，符合标准，表明 10 批杜仲叶药材共有峰选择准确，提取液化学成分基本相同、共性特征明显。（2）指纹图谱中的共有峰峰面积与相对峰面积结果用 HPLC 检测时，以绿原酸成分峰做参照，标定提取液色谱图对应的共有峰，并观察其峰面积，计算相对峰面积。结果见下表。
由表 2-4-3，2-4-4 可知，10 批杜仲叶药材 HPLC 指纹图谱的共有峰有 8 个，以绿原酸峰面积为 1 的 8 个色谱峰的相对峰面积 RSD 值在 2.01％-2.85％之间，符合规定，其相对峰面积的 RSD＜3％。
（3）指纹图谱非共有峰面积计算结果
10 批杜仲叶药材指纹图谱共有峰面积占全部峰面积的平均百分比 99.51%，非共有峰面积占总峰面积平均百分比为 0.49％<10％，符合药材指纹图谱标准。
2.4.3.3 10 批杜仲叶药材指纹图谱的相似度相似度结果见表 2.29。
相似度分析结果表明，本试验所选取的 10 批杜仲叶样品指纹图谱与其对照图谱相似度均大于 0.9，此对照指纹图谱可作为杜仲叶药材标准指纹图谱。
2.4.3.4 方法学考察结果
（1）精密度试验结果
由表 2.30 和 2.31 可知，同一台仪器，测得的色谱指纹图谱的各共有峰，其相对保留时间和其相对峰面积 RSD 分别为 0.05％-0.11％和 1.15％-1.81％，满足小于 3.00％的要求，说明仪器精密度良好。
（2）重复性试验结果
由表 2.32，2.33 可知，同一台仪器测得的色谱指纹图谱的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积 RSD 分别为 0.022％-0.16％和 2.12％-2.70％，满足小于 3.00％的要求，说明仪器重复性良好。
（3）稳定性试验结果
由表 2.34，2.35 可知，同一台仪器测得的指纹图谱各共有峰相对保留时间和相对峰面积 RSD 分别为 0.018％-0.18％和 2.15％-2.74％，满足小于 3.00％的要求，说明样品溶液成分在 12h 内是稳定的。
2.4.4 讨论
高效液相法建立药材指纹图谱，注意试验环境一致性，否则生成图谱因受干扰影响准确性。
2.4.5 小结
本试验选取 10 批重庆产杜仲叶，采用热浸提取法制成绿原酸提取液，通过精密性试验、重复性试验和稳定性试验可知，各结果均符合指纹图谱建立标准，所以试验成功建立了重庆杜仲叶药材指纹图谱。
