摘要
猪流感（Swine influenza，SI）是由猪流感病毒 Swine influenza virus，SIV）引起的一种高度接触性传染的猪呼吸道疾病。临床主要表现为咳嗽、呼吸困难、发热、不同年龄、性别和品种的猪均能感染，是当今规模化猪场普遍存在且难以根治的群发性疾病。
由于猪同时具有禽流感病毒和人流感病毒的唾液酸受体，常被认为是产生新型重配病毒的“混合器”。SIV 在猪群中以 H1N1、H1N2 和 H3N2 为主要流行亚型，因此，开展对H1N1 亚型 SIV 的遗传演化分析具有重要意义。
本研究为了解鲁西地区猪群中 SIV 的流行情况，在最近 3 年期间，对鲁西地区不同养殖场和生猪屠宰场采集鼻拭子样品共计 1500 份。样品接种于 10 日龄非免疫鸡胚进行分离、鉴定，共分离到 5 株 H1N1 亚型 SIV。通过对分离株进行全基因组测序以及遗传进化分析，发现 5 株病毒基因呈现两种基因型。其中 SW/SD/LC9/17 毒株的 PB2、PB1、PA 和 NP 基因来源于 pdm/09 H1N1 病毒，HA、NA 和 M 基因来源于 EA H1N1 病毒，NS 基因来源于 CS H1N1 病毒。另外 4 株病毒 SW/SD/JN3/16、SW/SD/LC15/17、SW/SD/HZ18/18 和 SW/SD/HZ22/18 的 PB2、PB1、PA、NP 和 M 基因来自于 pdm/09 H1N1病毒，HA和NA来自于EAH1N1病毒，NS基因来源于CS H1N1病毒。均是源于EAH1N1、pdm/09 H1N1 和 CS H1N1 形成的重排毒株。对 5 株 SIV 分离株 HA 基因氨基酸序列关键位点进行分析后发现，3 株病毒其蛋白受体结合位点均发生了 G225E（以 H3 为标准）的变异，表明都可以与 Saα-2，6-Gal 受体结合，其在 HA 裂解位点上都只存在 1 个 R 残基，属于低致病性毒株的氨基酸特征。
关键词：猪流感病毒；H1N1；进化分析
Abstract
Swine influenza (SI) is a highly contagious respiratory disease caused by the swineinfluenza virus (SIV) Pigs of different ages and genders are susceptible to infection, withsymptoms of cough, dyspnea and fever It is a common disease that is widespread anddifficult to cure in today's large-scale pig farms Pigs have been proposed as the mixing vesselof new reassortment virus for both having the receptors of avian and human H1N1, H1N2and H3N2 are the main subtypes of swine influenza viruses, whereas H1N1 subtype is themost common one Therefore, it's essential to study the evolution of H1N1 subtype swineinfluenza viruses
In order to investigate the prevalence of SIV in pigs in west of Shandong province , atotal of 1,500 samples of nasal swabs were collected from different farms and pigslaughterhouses in west of Shandong province during 2018 Five strains of H1N1 subtypeSIV were isolated by 10 days embryonated eggs and identified by RT-PCR Through thewhole genome sequencing and genetic evolution analysis of the isolated strains, it was foundthat five virus genes showed two genotypes The PB2, PB1, PA and NP genes ofSW/SD/LC9/17 were derived from pdm/09 H1N1 viruses, HA, NA and M genes were derivedfrom EA H1N1 virus, and NS gene was derived from CS H1N1 viruses The other four strainsof SW/SD/JN3/16, SW/SD/LC15/17, SW/SD/HZ18/18 and SW/SD/HZ22/18 have PB2, PB1,PA, NP and M genes from pdm/ 09 H1N1 viruses, HA and NA from EA H1N1 viruses, NSgene derived from CS H1N1 viruses Which are derived from the reassortant strains formedby EA H1N1, pdm/09 H1N1 and CS H1N1 viruses The key sites of the amino acid sequenceof the 5 strains of SIV isolates were analyzed It was found that the HA protein of the 3viruses exhibited the G225E (H3 Numbering) mutations indicating that they all could bind tothe SAa-2,6-Gal receptor and their HA proteolytic cleavage site presented the R amino acidresidue which is characteristic of the low pathogenic HA strains
Keywords: swine influenza virus；H1N1；evolutionary analysis
目录
1 前言
1.1 猪流感的流行概况
猪流感（Swine influenza，SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起的一种急性接触传染性呼吸道疾病。临床表现主要以咳嗽、流鼻涕、呼吸困难等为特征，不同年龄、品种和性别的猪均能感染，并且还会与呼吸道的病毒和细菌继发或混合感染，从而提高了死亡率（殷震等，1997）。SI 不仅会对养殖业造成重大的经济损失，而且还严重威胁着人类的健康。目前世界各地均有相关的报道。SIV 属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），为 A 型流感病毒，是一种有囊膜、分节段、单股负链的 RNA 病毒，病毒粒子中包含 8 个 vRNA 片段。猪是流感病毒中间传播的重要中间宿主，猪体内同时含有禽型（SA-α-2，3-Gal）受体和人型（SA-α-2，6-Gal）受体，因此猪常被认为是人、禽和猪流感病毒通过基因重排并产生新的病毒的“混合器”（Castrucci et al，1993）。
猪流感在全球范围内流行较广，自从上个世纪 30 年代 shope 分离到第一株猪流感病毒后（shope，1930），在后续的几十年里先后发现了多种亚型的 SIV，目前世界猪群中主要流行的猪流感病毒亚型为欧亚类禽型 H1N1，经典型 H1N1，类人型 H1N1 和类人型H3N2 以及它们之间形成的重配病毒。因此对猪流感的流行病学以及生物学特性研究具有极其重要的公共卫生学意义。
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1.1.1 类禽型 SIV
1.1.2 经典型 SIV
1.1.3 类人型 SIV
1.1.4 其他亚型 SIV
1.2 猪流感病原、致病性以及分子基础研究
1.2.1 猪流感病毒
1.2.2 SIV 的致病性
1.2.3 SIV 的分子基础研究
1.3 SIV 基因组及主要结构
1.4 SIV 基因所编码蛋白的结构与功能
1.4.1 血凝素（hemagglutinin，HA）
1.4.2 神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）
1.4.3 核蛋白（Nucleoprotein，NP）
1.4.4 基质蛋白（Matrix Protein，M）
1.4.5 非结构蛋白（Nonstructural protein，NS）
1.4.6 聚合酶蛋白（Polymerase）
1.5 SIV 的复制
1.6 SIV 种间传播机制
1.7 SIV 的抗原变异
1.9 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.2 主要试剂及引物
2.3 方法
2.3.1 样品的采集及处理
2.3.2 病毒的分离与纯化
2.3.3 病毒 RNA 的提取及反转录
2.3.4 病毒亚型鉴定、基因片段的 PCR 扩增及产物回收
2.3.5 病毒全基因序列测定
2.3.6 序列的拼接与分析
3 结果
3.1 病毒的分离鉴定及全基因组扩增
3.2 HA 基因的分析
3.2.1 核苷酸的遗传进化分析
3.2.2 同源性分析
3.2.3 氨基酸序列分析
3.3 NA 基因的分析
3.3.1 核苷酸的遗传进化分析
3.3.3 氨基酸的序列分析
3.4 PB2 基因的分析
3.4.1 核苷酸的遗传进化分析
3.4.2 同源性分析
3.5 PB1 基因的分析
3.5.1 核苷酸的遗传进化分析
3.5.2 同源性分析
3.6 PA 基因的分析
3.6.1 核苷酸的遗传演化分析
3.6.2 同源性分析
3.7 NP 基因的分析
3.7.1 核苷酸的遗传进化分析
3.7.2 同源性分析
3.8 M 基因的分析
3.8.1 核苷酸的遗传进化分析
3.8.2 同源性分析
3.9 NS 基因的分析
3.9.1 核苷酸的遗传进化分析
3.9.2 同源性分析
4 讨论
5 结论
参考文献
