摘 要： 人们已在卵泡发育的不同阶段和不同细胞中均检测到小RNA(miRNAs)的存在，并在成熟卵泡的卵泡液中也发现外泌体miRNAs。miRNAs不仅参与调控正常的卵泡发育过程，其异常调控也可导致一些卵巢疾病的发生。为进一步系统阐明miRNAs对卵泡发育的调控机制，寻找可以预测卵母细胞发育质量的外泌体miRNAs,本文从颗粒细胞发育、卵母细胞发育和激素合成等方面总结了miRNAs对卵泡发育的调控作用。
关键词 : 小RNA;卵泡发育;颗粒细胞;卵母细胞;激素合成;
Abstract： In recent years, microRNAs(miRNAs)have been detected at different stages of follicular development and in different cells of follicles.Extracellular vesicle(EV)-derived miRNAs have also been detected in the follicular fluid of mature follicles.miRNAs participate in the regulation of normal follicular development, and the regulation disorder may lead to the occurrence of some ovarian diseases.In order to further systematically elucidate the regulatory mechanism of miRNAs on follicular development and find suitable EV-derived miRNAs that can predict oocyte development, we reviewed the functions of miRNAs in follicular development from the perspectives of granulosa cell development, oocyte development, and hormone synthesis.
Keyword： microRNAs; follicular development; granulosa cell; oocyte; hormone synthesis;
Fund：Supported by the Scientific and Technological Research Project of Jilin Province(20200201132JC);the Health Research Project for the Training of Young Talents of Jilin Province(2018Q047);the Scientific and Technological Innovation Project of Jilin City(201831721);the Scientific and Technological Research Projects of the Education Department of Jilin Province During the “Thirteenth Five-Year Plan” Period(JJKH20191065KJ,JJKH20200454KJ);the Scientific and Technological Development Project of Traditional Chinese Medicine of Shandong Province(2019-0463);Undergraduate Training Program for Innovation and Entrepreneurship of Jilin Province(dc201952,dc201954);
高通量测序技术的飞速发展为研究非编码RNA提供了极大便利，鉴于非编码RNA在生殖系统发育调控中的重要作用，关于其调控机制的阐明也成为目前的研究热点，引起了人们极大的关注[1,2]。非编码RNA包括小RNA(microRNAs, miRNAs)、长链非编码 RNA(long non-coding RNAs, IncRNAs)和环状 RNA(circular RANs, circRNAs)3大类，其中以miRNAs的研究最为广泛[3]。miRNA于1993年被发现，是一种内源性22～24 nt大小的单链非编码RNA[4]。成熟的miRNAs与Argonaute1(AGO1)等其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC),miRNA通过其5’端的种子序列与靶 mRNA 3’非编码区(3’ UTR)完全或不完全的互补结合，也可通过识别靶mRNA 的开放阅读框，将与之结合的AGO蛋白定位到靶mRNA上，导致靶mRNA 降解、基因沉默或翻译抑制，从而调控靶基因表达，影响细胞增殖、分化和凋亡[5,6]。
卵泡发育是一个高度精确、有序和周期性过程，从原始卵泡激活开始，逐渐激发周围健康小卵泡的生长及优势卵泡的选择，并伴随着一系列卵母细胞和周围体细胞(尤其是颗粒细胞)的分化。通过生物信息学分析，Zhang等[7]在优势卵泡的生长和选择过程中，筛选出15个参与调控的miRNAs和139个相关的信号通路。这些miRNAs和相关的信号通路调控卵泡发育过程中的细胞增殖、分化、激素合成和卵母细胞的成熟及排卵等一系列重要事件，影响着卵泡发育的结局[8,9]。本文总结了miRNAs在卵巢颗粒细胞增殖与凋亡、卵母细胞发育和激素合成等方面的调控作用，以期为阐明其在生殖发育机制和生殖疾病机理的调控作用奠定基础。
miRNAs在颗粒细胞发育中的调控作用
卵泡发育过程伴随着颗粒细胞的快速增殖和分化，颗粒细胞在卵泡发育过程中起着重要的营养支持作用，可通过旁分泌以及与卵母细胞间的缝隙连接，为卵母细胞输送营养物质，调节卵母细胞的生长和成熟，并通过分泌大量性激素维持卵泡的正常功能。因此，颗粒细胞的正常发育是卵泡发育的基础。研究发现，颗粒细胞的增殖和凋亡受多种因素，如生长因子、激素、凋亡蛋白和氧化还原酶类等的调控[10,11],而miRNAs则通过多种途径调控这些蛋白和激素等物质的合成，进而调控颗粒细胞的发育[12]。
生长因子途径 在颗粒细胞的生长发育过程中存在着一类重要的生长因子-转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)[13],研究发现这类生长因子通路受miR- 10a和miR- 10b调控[14]。miR- 10家族可调控TGF-β通路中的许多关键基因，如促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、纤维母细胞生长因子9(fibroblast growth factor 9,FGF9)、激活素A、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)4和BMP15的表达，进而影响颗粒细胞的增殖和分化[14]。miR- 125b则通过靶向作用于骨形态发生蛋白受体1B(bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B)mRNA,影响BMPR1B蛋白的表达，改变Bcl- 2/Bax比值[15],诱导颗粒细胞凋亡。Chi-miR- 4110和miR- 424/503靶向作用于TGF-β信号通路中的Smad2和Smad7基因 mRNA,促进颗粒细胞凋亡[16,17]。同时有研究发现，激活素A的表达可负反馈下调miR- 424/503和miR- 10家族的表达，协同调控颗粒细胞的增殖[17]。且Smad4也可结合于miR- 143的启动子区，负反馈下调miR- 143的表达，逆转miR- 143介导的颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[18]。
激素受体途径 卵泡刺激素受体(follicular stimulating hormone receptor, FSHR)在调控哺乳动物卵泡发育过程中发挥重要作用。在卵巢卵泡闭锁过程中，FSHR表达下调，敲除FSHR可导致颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[19],但其具体作用机制尚不明确。通过研究miRNAs在颗粒细胞发育中的作用，发现FSHR是miR- 143的重要作用靶点，在卵泡闭锁期间miR- 143的表达上调，其通过靶向作用于FSHR,降低了细胞内信号分子，如蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase, AKT)和磷酸化 AKT(phosphorylated AKT,P-AKT)的表达水平，影响细胞的代谢活动，加速颗粒细胞凋亡，促进卵泡凋亡[18,20]。miRNAs可通过促性腺激素受体途径参与调控颗粒细胞和卵泡的发育。
凋亡因子途径 在卵泡发育的不同阶段，会有99%以上的卵泡闭锁退化。卵泡闭锁主要是由颗粒细胞凋亡引起的，许多促凋亡因子参与调控了这一过程[21,22],叉头框转录因子O1(forkhead box transcription factor O1,Fox O1)是其中一类重要的促凋亡调控因子[23,24]。研究发现miR- 181a可靶向抑制FoxO1的去乙酰化酶沉默信息调节因子 1(silent informa-tion regulator 1,SIRT1)的表达，促进FoxO1乙酰化，增强FoxO1表达，从而促进颗粒细胞的凋亡。Zhang等[25]研究发现，利用过氧化氢处理颗粒细胞可增加颗粒细胞中miR- 181a的表达，并通过FoxO1通路促进颗粒细胞的凋亡，但如果敲除miR- 181a, 则阻止了过氧化氢诱导的颗粒细胞凋亡。可见，miRNAs在颗粒细胞凋亡和卵巢老化过程中起重要的调控作用。
miRNAs在卵母细胞发育中的调控作用
在卵泡发育过程中，卵母细胞逐渐具备了完成减数分裂成熟和支持后续早期胚胎发育的能力。卵母细胞的发育成熟，受颗粒细胞增殖和凋亡的调控。在卵母细胞发育的前期，颗粒细胞快速增殖，为卵母细胞的生长提供丰富的营养物质；但在初级卵母细胞完成第1次减数分裂前，卵母细胞的发育已经完成，颗粒细胞在激素和促凋亡因子等作用下，发生凋亡退化，逐渐失去了与卵母细胞之间的联系，此时如果颗粒细胞凋亡退化异常，将会影响卵母细胞完成第1次减数分裂。
近年研究表明，miRNAs表达于卵泡发育的不同阶段，包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡，参与调控整个卵泡的发育和卵母细胞的成熟过程[26]。人们已在卵母细胞发育的不同阶段发现了miRNAs表达模式的差异。Xiong等[27]对GV期和MⅡ期卵母细胞进行了高通量测序，结果显示：MⅡ期卵母细胞中有47个miRNAs表达上调，28个miRNAs表达下调，在表达上调的let- 7i、miR- 10b、miR- 10c、miR- 342、miR- 143、miR- 146b和miR- 148等miRNAs中，miR- 342的表达水平升高了9.25倍。为进一步阐明这些在GV期和MⅡ期卵母细胞中差异表达的miRNAs的调控作用，Song等[28]研究了7个差异表达的miRNAs调控的信号通路和靶基因，结果发现：miR- 21、miR- 27b- 3p、miR- 10a- 5p、miR- 10b- 5p参与了猪卵母细胞脂肪酸代谢的调控，miR- 27b- 3p调控着GV期和MⅡ期卵母细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)的表达，在卵母细胞的体外成熟液中添加PPARγ激动剂，可显着提高卵母细胞的成熟率和早期胚胎的发育能力。在卵母细胞体外成熟过程中，显微注射miR- 130b前体或抑制剂能降低靶基因SMAD5和MSK1的表达，显着降低第一极体的排出和卵母细胞进入第二次减数分裂中期的比例[29];相反miR- 130b的过表达则可明显增加颗粒细胞的数量，促进颗粒细胞增殖，进而抑制卵母细胞成熟[29]。miR- 378则在卵泡发育的早期通过降低BMP15和GDF9的表达，减弱卵母细胞和颗粒细胞的相互作用，从而降低卵母细胞成熟率[30]。因此，在卵母细胞发育的不同阶段，会受到不同类型miRNAs的精确调控，miRNAs的调控异常将直接影响卵母细胞成熟和卵巢功能。
近期人们在动物和人类卵泡液中检测到一类重要物质-外泌体miRNAs(extracellular vesicle containing miRNA,EV-miRNAs)[31],该物质会通过细胞和细胞之间的传递，完成细胞间的交流[32]。da Silveira等[33]将含有miRNAs的外泌体添加到卵母细胞的成熟培养液和早期胚胎的培养液中，显着提高了胚胎细胞中bta-miR- 631的表达水平，改变了胚胎中DNA的甲基化和羟甲基化水平，产生了不同的囊胚发育率。EV-miRNAs参与调控了卵母细胞的成熟和支持后续胚胎发育能力的获得。在卵母细胞成熟过程中，卵泡液中miRNAs的表达随着雌性年龄和卵泡发育阶段的变化而变化。da Silveira等[34]在青年马(3～10岁)不同发育阶段的卵泡液中发现了26个miRNAs的差异表达，而在老年马(20～26岁)不同发育阶段的卵泡液中发现了55个miRNAs的差异表达，这些差异表达的miRNAs包括miR- 23a、miR- 222、miR- 24、miR- 132、miR- 320、miR- 520c- 3p 、miR- 222和miR- 181a等，它们参与调控着卵泡雌激素合成、FSH循环水平、TGF-β信号通路、WNT信号通路和排卵等过程，这些过程与卵母细胞的发育、卵巢的老化和衰老密切相关。Diez-Fraile等[35]比较了年轻女性(<31岁)和中老年女性(>38岁)卵泡液中EV-miRNAs的表达，结果发现：miR- 21- 5p仅在年轻女性的卵泡液中分离到，可靶向作用于TGF-β信号通路；而miR- 134、miR- 190b和miR- 99b- 3p仅在中老年女性卵泡液中发现，可能与低质量的卵母细胞密切相关。虽然EV-miRNAs的表达类型和水平在马和人都存在物种的差异，但它们都参与了调控卵泡发育的重要活动和重要信号通路，在卵泡发育和卵母细胞成熟中发挥了重要作用。
此外研究发现，EV-miRNAs与M Ⅱ期卵母细胞的质量密切相关，其表达变化影响着体外受精的结果[36]。Martinez等[37]收集了126名进行体外受精女性的卵泡液，分析了卵泡液中EV-miRNAs的表达水平，结果发现：与正常受精组的卵母细胞相比，未受精卵母细胞的卵泡液样本中Hsa-miR- 92a和Hsa-miR- 130b的表达显着升高；卵泡液中Hsa-miR- 888的过度表达，以及Hsa-miR- 214和Hsa-miR- 454的表达下降与D3的胚胎质量密切相关。对含有成熟卵母细胞的单个卵泡的卵泡液进行样本分析发现，miR- 663B在人卵泡液中的表达水平与活囊胚的形成率呈显着负相关[38]。通过胞浆内单精子显微注射研究发现，来自高水平Hsa-miR- 320a和Hsa-miR- 197卵泡液的卵母细胞可获得高质量发育的胚胎[39]。卵泡液中miRNAs的类型和表达水平在一定程度上与卵母细胞的成熟质量有关，而卵母细胞的发育质量直接决定后期胚胎的发育状况。如果miRNAs能成为体外受精后胚胎发育潜能的客观评价指标，将大大提高辅助生殖技术的成功率，减少多胎的发生率。
miRNAs对卵泡合成和分泌性激素的调控作用
在卵泡发育成熟过程中分泌多种激素，包括雌激素、孕激素和少量雄激素，这些激素调控颗粒细胞的增殖与分化、卵母细胞的发育成熟及排卵[40,41]。研究发现，这些激素的合成受miRNAs调控，miR- 320a可靶向作用于转录因子RUNX2的3’UTR,通过调节CYP11A1和CYP19A1的表达，增强颗粒细胞中类固醇激素的合成[42]。雌激素的合成受FSH和促黄体生成激素(luteinizing hormone, LH)的调控，在颗粒细胞和卵泡膜细胞上分别有FSH受体(FSH receptor, FSHR)和LH受体(LH receptor, LHR)的表达。LHR mRNA的稳态水平是通过LHR mRNA 结合蛋白(LHR mRNA binding protein, LRBP)控制其降解速度来维持的。Menon等[43]研究显示，miR- 122调控LRBP的表达，间接决定了细胞中LHR mRNA的水平。在排卵前，为应对LH峰的出现，LHR mRNA表达会随着miR- 122和LRBP水平的降低而降低。miRNAs根据卵泡发育的需要，精确地调控卵巢激素的合成和分泌。
卵泡对雌激素的合成也受促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone, CRH)信号通路的调控，Yu等[44]发现该调控通路需要miR- 375的介入，CRH通过激活胞内PKA-p38 MAPK信号通路，促进miR- 375表达，miR- 375结合到特异性蛋白1(specificity protein1,SP1)mRNA的 3’UTR 区，抑制SP1蛋白的表达，下调了Cyp19a1转录，进而抑制了颗粒细胞中E2的合成。Wang等[45]发现，miR- 764- 3p可通过影响类固醇生成因子- 1(steroidogenic factor- 1,SF- 1)mRNA的稳定性，抑制SF- 1的表达，进而抑制了SF- 1下游的靶基因Cyp19a1的表达，影响E2的合成。Dai等[46]研究显示，miR- 133b是通过结合到Foxl2 mRNA的3’UTR区，降低了Foxl2的表达水平，抑制了Foxl2结合到类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)和Cyp19a1基因的启动子区，降低了StAR和Cyp19a1的表达，进而影响E2的合成。目前人们已经发现，不同类型的miRNAs通过不同的信号通路，精确调控着卵泡激素的合成，但具体哪条通路起了主要作用或是这些通路之间是如何相互作用调控着激素合成还不清楚，尚需进一步展开研究。
miRNAs对卵泡发育障碍性疾病的调控作用
卵泡发育障碍性疾病是造成雌性/女性不孕的重要原因，也是生殖医学/生殖生物学的研究重点，越来越多的研究表明，miRNA在常见卵泡发育障碍性疾病，如多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)和卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)中发挥作用。PCOS的特征是卵巢多囊样改变、不排卵和高雄激素血症。Naji等[47]研究发现，在PCOS患者颗粒细胞中miR- 93和miR- 21水平显着升高，且游离睾酮和游离雄激素指数与miR- 93和miR- 21的表达呈正相关，miRNA作为雄激素合成通路的中间调控因子，其异常升高引起了患者的高雄激素血症。MiR- 320a在PCOS患者颗粒细胞中的表达显着下调，其靶向作用于雌激素合成的转录调控因子RUNX2,显着降低了CYP11A1和CYP19A1的表达，导致颗粒细胞中雌激素合成显着减少[42]。此外，在PCOS患者的颗粒细胞中也发现了miR- 323- 3p水平下调。MiR- 323- 3p可靶向作用于胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF- 1)mRNA,抑制IGF- 1的表达，从而下调雄激素受体、抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体、细胞色素P450 19A、表皮生长因子受体和锌指蛋白转录因子GATA- 4的表达水平，导致患者体内雌激素合成减少，雄激素水平显着升高，出现高雄激素血症[39]。miR- 27a- 3p则通过作用于cAMP反应元件结合蛋白1,下调Cyp19a1的表达，导致雄激素和雌激素表达水平失调，促进了颗粒细胞的凋亡[48]。因此，颗粒细胞miRNA调控紊乱，将会引起激素失调，颗粒细胞凋亡，与PCOS的发生密切相关。
POF是指卵巢功能衰竭、卵巢中卵母细胞数量显着减少所导致的40岁之前闭经的现象，其特点是颗粒细胞功能紊乱、雌激素水平降低，促性腺激素水平升高，但具体发生机制尚不清楚。Chen等[49]在POF患者血浆和卵巢颗粒细胞中发现miR- 146a的表达显着升高，miR- 146a可靶向调控白细胞介素受体相关激酶和肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达，通过caspase级联反应促进颗粒细胞凋亡，导致卵泡闭锁。Cho等[50]研究发现，miR- 146a单核苷酸多态性会改变FOXO3、FOXL2 和CCND2的mRNA水平，使其靶基因表达异常，进而导致颗粒细胞功能紊乱，卵巢卵泡发育缺陷。MiR- 938可靶向结合到促性腺激素释放激素受体(gonadotropin-releasing hormone receptor, GnRHR)mRNA上，调控着促性腺激素的循环水平，进而影响卵巢卵泡发育。miR- 938 G>A多态性可引起GnRHR表达的异常调控，造成卵泡发育受阻，出现POF[51]。目前已发现多种miRNA参与了POF发生的调控，这些miRNAs作为POF的诊断、靶向治疗或预后标志物的选择具有潜在的应用价值，对于阐明POF的发生机制也是至关重要。
未来展望
随着对miRNAs研究的不断深入，人们逐渐认识到miRNAs作为细胞活动的关键调控分子，不论是在正常生理状态还是病理状态下都广泛表达，其调控卵泡细胞的增殖、分化和凋亡，影响卵巢正常的生理和病理过程，未来需要进一步阐明其在卵泡发育中的调控机制。miRNAs具有高度保守性和稳定性，因此进一步挖掘miRNAs在生殖领域作为检测标志物的研究，以其进行卵巢疾病的诊断和治疗并作为辅助生殖技术选择优质卵母细胞和胚胎的客观标准，将对筛查和治疗卵巢疾病、提高受孕率和减少多胎发生率都具有重要意义。
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