有汗性外胚叶发育不良患者基因突变检测

　　有汗性外胚叶发育不良(Hidrotic ectodermal dys?plasia, HED，MIM 129500)是一种以甲、毛发及掌跖(或牙齿)等外胚层起源的组织发育缺陷为主要特征的常染色体显性遗传皮肤病。1929年，Clouston报告了一个法籍加拿大家系患有该病后，引起了人们的重视，后又称其为Clouston综合征。该病典型的临床表现有指（趾）甲营养不良、部分或完全脱发、掌跖部皮肤角化过度、牙齿发育不全，部分患者可出现白内障、斜视、骨骼改变、听力减退、指(跖)畸形，少数有癫痫发作、智力障碍、神经性耳聋等。汗腺和皮脂腺功能通常正常。由于受遗传和环境等多方面因素影响，这些症状不一定同时存在，有的仅有其中1~2种表现，导致临床上有时难以明确诊断。目前研究已证实GJB6基因为该综合征的致病基因。我们采用聚合酶链反应和DNA直接测序法，对1例可疑HED的患者进行了基因突变检测，为产前诊断和遗传咨询提供依据。

　　1、 对象与方法

　　1.1 研究对象 患者，男，13岁，2008年就诊于安徽医科大学第一附属医院，其母亲诉患者出生后即发现眉毛和头发缺失。后眉毛和头发部分长出，呈稀疏、黄、软，但仍呈部分缺失，且甲渐增厚。患者父母亲、妹妹和其他家族成员均无类似表现。患者父母非近亲结婚。体检：一般情况，发育及智力正常，口腔粘膜及牙齿正常，部分眉毛、后枕部头发缺如，指(趾)甲远端1/3稍增厚(见图1)；汗腺和皮脂腺分泌正常，掌跖部未见明显异常。甲屑真菌镜检及培养均为阴性。患者初诊为“先天性厚甲症”，经筛查先天性厚甲症的K6a、K6b、K16和K17基因无异常突变后，排除了先天性厚甲症。后经国际厚甲组织成员Frances博士等专家义诊，认为该患者为HED，需进行GJB6基因检测。

　　1.2 方法

　　1.2.1 外周血DNA的提取 在取得患者及家属的知情同意后，抽取患者及家庭中正常人的静脉血2mL置于EDTA抗凝管中。采用基因组DNA快速抽提纯化试剂盒（上海生工生物工程技术有限公司）提取基因组DNA，同时提取100例健康对照者(均为门诊随机挑选的非外胚叶发育不良无血缘关系的患者) DNA。

　　部分患者的DNA带到英国Ninewells医学院分子和细胞病理学系实验室由Frances博士检测。

　　1.2.2 引物设计 根据文献合成引物的序列：正向：5’-GGACGCTGCACACTTTCATC-3’；反向：5’-GCTTGGGAAACCTGTGATTG-3’，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，引物采用PAGE纯化后稀释为20μmoL/L备用。

　　1.2.3 PCR 扩增 扩增条件：94℃预变性 5min 后，94℃变性45S，56～64℃复性45S，72℃延伸45S，共30个循环，72℃后延伸10min，1.5％的琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用Exonl和SAP酶切纯化，将纯化产物进行测序PCR反应，然后再进行测序前纯化。

　　1.2.4 DNA测序 直接测序 将测序PCR纯化产物上样，经CEQ8800型DNA全自动测序仪(美国贝克曼库尔特公司)直接测序，测序结果采用Chromas 2.0软件对基因序列进行对比分析，确定突变位点。

　　2、 结果

　　我们与Frances的测序结果均发现：患者GJB6基因上第31位碱基发生杂合突变，鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代；由此，第11位氨基酸密码子由GGG突变成AGG，导致正常的甘氨酸(G)被精氨酸(R)替代，即G11R突变(见图2)。而对患者家庭中的正常人和100例健康对照进行GJB6基因的突变筛查，并没有发现同样的碱基改变，说明该突变是致病突变而不是单核苷酸多态性(SNP)。

　　3、 讨论

　　有汗性外胚叶发育不良是一种以毛发、牙齿、汗腺、甲发育异常为特征的常染色体遗传性疾病。发病率约为1/100 000。最初的文献报道多见于法籍加拿大人，后来各种族中均有报道。由于临床表现多变，多数症状不典型，特别是与一些临床症状有交叉的疾病易混淆，如：先天性厚甲症。先天性厚甲症主要由角蛋白(K6a、K6b、K16和 K17)基因突变引起，早期的研究提示HED亦可能是由于角蛋白缺陷引起的疾病。后来，几个相互独立的研究小组通过遗传连锁分析的方法排除了角蛋白基因族为致病基因。通过全基因组关联分析将致病基因定位在（13q11±12.1）区域内的基因，并通过独立的精细定位研究得以证实。位于该区域内的两个候选基因为GJB6及GJB2，分别编码缝隙连接蛋白30（Cx30)和缝隙连接蛋白26(Cx26)。随后，GJB2作为HED的候选基因被排除。

　　2000年Lamartine等发现HED与GJB2有关，并在2个HED 家系中检测出 G11R 和 A88V 突变，从而证实GJB6基因为HED的致病基因。缝隙连接蛋白30是构成相邻细胞间缝隙连接通道的蛋白族成员之一。连接蛋白有保守的结构模式：四个跨膜域，两个细胞外领域和三个胞质域(见图3)。缝隙连接允许分子量小的离子、代谢物及一些第二信使(cAMP、Ca2+、IP3)通过，这些离子和小分子代谢物对细胞生长和各种组织的分化至关重要。GJB6基因与表皮、毛发、指甲、大脑和/或内耳的多种遗传性疾病相关。GJB6基因突变后，Cx30蛋白结构异常，导致在细胞表面形成连接蛋白半通道功能异常，生成ATP向细胞外介质泄漏，这样增加ATP含量可能会作为旁分泌信使，改变了控制角化细胞的增殖和分化，导致HED表皮因素的改变。GJB6基因发现与耳聋疾病相关，一些HED患者中也存在听力损害的报道，但GJB6基因如何引起不同疾病的发病机制至今不清。

　　在过去的几十年里，除了多次发现G11R和A88V突变与HED相关外，Frances等人在2002年发现一新突变V37E和Baris等人在2008年发现另一个新的突变 D50N。目前 G11R、V37E、D50N 和 A88V 是迄今发现HED患者的4个突变，分别导致非同义替换氨基酸在N端尾蛋白、跨膜域，细胞外的领域(图3)，除我们报道的这例G11R突变外，目前国内仍有两例G11R突变报道。值得一提的是G11R突变是在亚洲人群HED中发现的唯一突变。

　　综上，本研究不仅发现了G11R突变，而且为该家系进行产前诊断和遗传咨询奠定了基础，同时提示我们已发现的突变点对确诊可疑病例具有重要意义。

　　致谢 感谢国际厚甲组织对患者的资助；感谢国际厚甲组织成员Frances Smith博士给予的技术支持和突变验证。