甲状腺结节分子诊断标记物检测方法包括：基因突变和重排检测、基因表达分类谱（gene ex-pression classifier,GEC）和 Galectin-3 等免疫组化染色。基因突变检测（包括BRAF、NRAS、HRAS、KRAS 基 因 突 变 以 及 RET/PTC1、RET/PTC3 和PAX8/PPARγ基因重排）已经被认为具有相对较高特异性度阴性预测值的“确诊性”检测，然而仍受到敏感度（48%~63%）相对较低的限制[1-2].
GEC检测由于具有相对较高的敏感度和阴性预测值，被认为是一种“排除性”检测手段，但特异度相对较低（48%~53%），无法作为确诊甲状腺癌的检测方式[3].通过诸如Galectin-3和HBME-1等免疫组化染色，研究结果具有相对较高的特异度，但也受到敏感度较低的限制[4].
分子诊断技术在甲状腺结节诊治中的价值在于：（1）提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性；（2）指导甲状腺癌风险分层及预后评估；（3）提供治疗决策信息（即是否进行手术或手术范围的确定）；（4）针对靶基因的全新治疗手段的研究。
1 术前细针穿刺细胞学检查（FNA）联合分子检测
技术是一种更为精准的诊疗手段根据Bethesda系统[5] ,有20%~25%的细针穿刺细胞学检查（fine needle aspiration,FNA）诊断为不能确定性质的结果，包括3类：非典型性病变或滤泡性病变（atypia of undetermined significance/fol-licular lesion of undetermined significance,AUS/FLUS）、滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤（follicularneoplasm/suspicious for follicular neoplasm,FN/SFN）以及可疑恶性（suspicious for malignancy,SUSP），其恶性风险分别为16%、26%和75%[6].虽然重复进行 FNA 或许有助于恶性风险相对较低的 AUS/FLUS结节进一步诊断，但通常仍须进行组织病理学检查以作出最终诊断，无法避免FNA技术仍存在的局限性。
对 于 AUS/FLUS,BRAF 突 变 、RET/PTC 或PAX8 / PPARγ重排检测的阳性结果，对甲状腺癌的诊断特异度为100%,同时诊断敏感度较FNA提高至63%~80%;而GEC诊断敏感度为90%（95%CI 74%~98%）、阴性预测值为 95%（95%CI 85%~99%），通过GEC评估可将AUS/FLUS结节恶性风险比率由24%降至5%,对指导病人避免手术治疗而进行随访观察具有诊断意义[3].
对于FN/SFN,18%~39%的标本至少存在1个分子靶标阳性结果，提示恶性风险为 87%,其余13%的良性结节来源于RAS突变，恶性潜能尚不明确[7].但是，目前检测的突变谱并不能涵盖所有甲状腺癌基因，所以即便突变谱检测结果全为阴性的结节仍然存在14%的恶性风险[1].GEC检测对AUS/FLUS 结节恶性诊断的阴性预测值为 94%（95%CI 79%~99%），阳性预测值为 37%（95%CI23%~52%），敏感度为80%,特异度为12%[3,8].
对于SUSP,美国甲状腺协会（ATA）指南推荐的外科诊治策略与甲状腺癌相似。但是近期研究显示，SUSP进行突变谱检测的阳性预计值>95%,其中 20%~60%可检测到 BRAF 突变，且几乎100%为甲状腺癌[9-10];而当联合检测结果全为阴性时，仅28%的病人为甲状腺癌[1].此外，由于GEC检测的阴性预测值为85%,且阳性预测值与单独进行FNA检查（76%）相似。因此，其辅助诊断的意义尚不明显。
2015年ATA指南讨论稿推荐对于FNA诊断为不能确定性质的结节，应依据临床风险因素、超声特征、病人的选择与可能获得的基因突变分子检测结果选择治疗方式，医生在临床决策中应告知病人可有的选择及可行性。若分子检测能够改变预期手术决策，术前应考虑进行BRAF突变或突变谱检测，如果重复FNA和（或）分子检测无法进行，或其结果仍不明确，可再决定随访观察或诊断性外科手术。
2 分子诊断对复发风险评估的潜在影响
尽管 30%~67%的微小乳头状癌（Papillarythyroid microcarcinoma,PTMC）中存在 BRAF 基因突 变 ,但 其 总 体 的 临 床 复 发 率 却 仅 为 1% ~6%[11-12].但是当存在腺外侵袭的多灶性PTMC合并 BRAF V600E 突 变 时 ,其 复 发 率 则 高 达20%[13].2015年ATA指南讨论稿提出将局限于甲状腺内的PMTC,不论是否存在BRAF突变纳入低危组；而将合并 BRAF 突变、腺外侵袭的多灶性PMTC（约占PMTC的10%）纳入中危组。
BRAF单基因检测对指导甲状腺癌（1~4 cm,N0,M0;33%病人存在BRAF突变）的风险分层具有潜在价值。5年随访数据显示，BRAF V600E突变病人复发率为8%,而BRAF野生型病人复发率仅有 1%（P=0.003）[14].多变量分析中，BRAFV600E突变也是甲状腺癌未得到彻底根治的惟一临床病理学预测因子，提示BRAF基因检测有望指导腺内的乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carci-noma,PTC,直径1~4 cm）病人进行更精准的风险分层。2015年ATA指南讨论稿提出将局限于甲状腺内的原发病灶直径 1~4cm 的乳头状癌合并BRAF突变（如果情况可知）纳入中危组。
更为准确的甲状腺癌预后评估应当基于更为广泛的遗传学分析，高侵袭性甲状腺癌可能与携带以下基因突变相关：（1）BRAF V600E联合其他致癌基因的突变；（2）TERT启动子突变（独立或与BRAF基因突变共存）；（3）TP53突变合并有1个以上的已知致癌基因突变，尤其当BRAF 突变合并 PIK3CA、TP53、AKT1 或 RET/PTC突变时，更有利于评估高复发风险等甲状腺侵袭性生物学行为[15],这将有望作为预测PTC不良预后更具特异性的标记物。
TERT启动子突变在甲状腺乳头状癌中发生率 为 7% ~22% ,在 滤 泡 状 癌（follicular thyroidcarcinoma,FTC）中发生率为14%~17%,低分化及未分化甲状腺癌中的发生率进一步增高[16-18].笔者在国际上首次报告中国人群甲状腺癌TERT启动子突变筛查，尤其普遍存在于高侵袭性甲状腺癌和BRAF V600E突变阳性甲状腺乳头状癌中，提示TERT启动子突变在甲状腺癌失分化与肿瘤进展等方面起到重要作用。尤其当TERT C228T 与BRAF V600E突变共存时，甲状腺乳头状癌侵袭性及复发风险显着增加，依据这一结果，我们可以提出一种新的高侵袭性甲状腺乳头状癌双突变亚型。TERT启动子突变是分化型甲状腺癌无病存活期（OR 4.68;95%CI 1.54~14.27）和病死率（HR10.35;95%CI 2.01~53.24）的独立预测因子[16].研究数据支持TERT启动子突变在甲状腺癌发生发展机制中作为一个重要的新的遗传事件，具有很强的生物学及临床意义。TERT 启动子突变与BRAF V600E突变联合诊断明显优于单突变检测，这项在甲状腺癌分子遗传学中的新发现，非常有希望成为具有极高生物学及临床价值的分子诊断及治疗靶标[19].
TP53突变多见于低分化和未分化甲状腺癌，可见于3.5%（2/57）的分化型PTC及11%（4/36）的分化型 FTC[20].其中，所有 TP53 突变同时合并BRAF（或BRAF和PIK3CA）突变的PTC均发展为肺转移，所有4例TP53阳性的FTC（未合并其他基因突变）均为嗜酸细胞性，其中3/4的肿瘤为广泛侵袭性FTC.
