在畜牧业生产过程中,利用抗生素治疗和预防疾病带来的种种弊端逐渐被人们所认识,2006年欧盟决定禁止使用任何抗生素作为饲料添加剂。益生菌作为一类能通过调控生物体微生态平衡进而有效促进宿主健康生长的活微生物制剂,一直被认为是抗生素的最佳替代者之一。关于对雏鸡肠道菌群的研究已有较多,但是关于益生菌和抗生素对肉雏鸡盲肠菌群发育规律的影响作用还鲜有报道。本研究以屎肠球菌和金霉素为试验材料,通过对不同日龄肉雏鸡盲肠内容物的16SrDNAV3区进行PCR-DGGE指纹图谱比较分析,从不同角度研究益生菌制剂的部分作用机制以及日粮中添加抗生素的可能影响。
1、材料与方法
1.1试验材料与试验动物
试验材料为华中农业大学农业微生物学重点实验室专利菌株(专利号:ZL201110452087.2)屎肠球菌HDRsEf1株,湖北华大瑞尔科技有限公司生产,每克菌粉的活菌数≥30亿。
试验动物为1日龄健康白羽肉鸡科宝500,购自湖北宜昌正大有限公司。
1.2试验设计与样品采集
1)屎肠球菌定植动物试验。选用1日龄健康白羽肉鸡80只随机分成对照组(玉米-豆粕基础日粮)和益生组(添加300g屎肠球菌菌粉/1000kg),每组分别在1、3、5、7、9、11日龄时颈静脉放血处死5只雏鸡,在超净台内快速采集盲肠内容物并混合,置4℃冰箱备用。
2)屎肠球菌和抗生素对雏鸡肠道菌群的影响试验。试验选用1日龄新生白羽肉鸡180只,随机分成对照组(玉米-豆粕基础日粮)、益生组(添加300g屎肠球菌菌粉/1000kg)和抗生素组(添加50mg金霉素/kg)。每组3个重复,每个重复20只鸡。试验周期为42d,每组分别在7、14、21、28、35、42日龄时颈静脉放血处死6只试验鸡,在超净台内快速采集盲肠内容物,将每个组的6只雏鸡内容物混合,置4℃冰箱备用。
1.3细菌总DNA的提取
参照文献,采用QIAampDNAStoolMiniKit,按照操作手册提取细菌总DNA。用核酸浓度测定仪测定总DNA浓度,置-20℃保存备用。
1.4RT-PCR
法检测盲肠中屎肠球菌、大肠杆菌和乳酸杆菌的数量实时荧光定量PCR所用的引物见表1。检测屎肠球菌数量的荧光定量PCR反应条件:
95℃预变性30s;95℃变性5s,60℃延伸30s,40个循环。检测大肠杆菌和乳酸杆菌数量的荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30s;95℃变性5s,55℃退火20s,72℃延伸30s,40个循环。每次荧光定量PCR循环结束后溶解曲线从65℃逐步升到95℃。荧光定量PCR体系的最终体积控制在20μL,反应试剂均按PremixExTaqTM试剂说明书的推荐量添加。
1.5基因组特异性片段
V3区的扩增为了检测各组肠道菌群的变化情况,用引物GC341f(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3′)和519r(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)扩增16SrRNA的V3区片段,扩增条件是94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火20s,72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸10min。
PCR反应体系(25μL):2×PCRmix12.5μL,上下游引物(10pmol/L)各1μL,DNA模板2μL,ddH2O补足至25μL。
1.6基因组特异性片段
V3区的变性梯度凝胶电泳(DGGE)使用Bio-RadDcode进行DGGE凝胶电泳。
变性剂梯度范围为38%~55%,100%的变性剂包含7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺。电泳在恒温60℃条件下1×TAE缓冲液中进行,先200V预电泳10min,然后65V电压电泳16h。参照文献[7]方法用硝酸银染色,对完成显色后的凝胶拍照,再用相应软件对图谱进行分析。
1.7数据分析
采用UPGMA进行聚类分析,以香农多样性指数H′表示菌群多样性的高低,SPSS18.0进行PCA分析和显著性差异分析。
2、结果与分析
2.1益生性屎肠球菌
HDRsEf1株在雏鸡肠道菌群定植的确定如图1所示,随着雏鸡日龄的增加,益生菌组中雏鸡盲肠中的屎肠球菌的数量逐渐增加,到第5日龄时基本达到稳定,而对照组的屎肠球菌的数量在5日龄以后逐渐降低,说明该株屎肠球菌HDRsEf1可以在雏鸡盲肠内定植,并且在5日龄时就基本达到稳定。
2.2大肠杆菌和乳酸杆菌数量的检测
由表2可见,饲料中添加屎肠球菌HDRsEF1和抗生素可以显著减少21日龄时雏鸡盲肠中大肠杆菌的数量(P<0.05),而在42日龄时益生菌组和抗生素组中的大肠杆菌的数量都有所下降,但差异不明显。同时,饲料中添加屎肠球菌HDRsEF1可以显著增加雏鸡盲肠中乳酸杆菌的数量,在42日龄时益生菌组与对照组和抗生素相比差异显著(P<0.05),在21日龄时差异不显著。
2.3DGGE图谱的分析与处理
1)DGGE图谱的聚类分析结果。聚类分析结果(图2)主要有2个分支,7日龄雏鸡盲肠微生物菌群与其他日龄的距离较远,而从14日龄到42日龄微生物菌群比较稳定,说明从7日龄到14日龄时微生物菌群产生了明显的变化。
2)DGGE图谱的相似性和多样性分析结果。
通过比较各处理组雏鸡在7日龄和14日龄、14日龄和21日龄、21日龄和28日龄、28日龄和35日龄以及35日龄和42日龄的盲肠微生物菌群之间的相似性,来评价肠道菌群的稳定程度,相似度越高则说明肠道菌群的变化越小,稳定度越高。由表3可以看出,除了7日龄与14日龄,益生菌组的其他相邻日龄之间的相似度指数均高于对照组和抗生素组,并且差异显著(P<0.05),说明在14日龄以后,益生菌组的肠道菌群相对于另外2组维持在比较稳定的状态。在3个处理组中,抗生素组在14到35日龄时的相似性指数均低于对照组和抗生素组,说明抗生素的添加会降低肠道菌群的稳定性。
由图3可见,3个不同处理组的雏鸡盲肠微生物菌群的多样性指数随日龄的增加均逐渐增大,各组之间的差异不显著,说明益生菌和抗生素的添加并不会影响肠道菌群的多样性指数。
3)DGGE图谱的主成分分析。对DGGE图谱的主成分分析结果与聚类分析的结果一致,如图4所示。
7日龄样品与其他日龄样品的距离较远,位于矩形方框的下部,说明7日龄盲肠菌群与其他日龄的差异较大。而14、28日龄和35、42日龄分居矩形方框上部的左右侧。
3、讨论
3.1屎肠球菌在雏鸡盲肠菌群的定植
益生菌在肠道内的粘附定植是其发挥生理作用的前提和基础。本文用RT-PCR技术来检测屎肠球菌HDRsEf1在盲肠的定植情况,检测的结果显示对照组在3日龄到7日龄时屎肠球菌的数量大致相同,Lu等利用分子生物学的方法研究发现,在肉鸡3日龄和7日龄的盲肠菌群中检测到的屎肠球菌拷贝数一样,与本研究对照组的检测结果一致。而益生菌组中的屎肠球菌的数量随着饲喂时间的增加而逐渐升高,在雏鸡5日龄时数量就基本达到稳定,说明该屎肠球菌HDRsEf1与雏鸡的盲肠粘膜的粘附性好,可以在盲肠稳定存活。
3.2益生性屎肠球菌和抗生素对雏鸡盲肠大肠杆菌和乳酸杆菌数量的影响
益生菌进入动物胃肠道后,可以通过产生抑菌物质或者产酸来抑制某些潜在有害菌和对酸性敏感的病原菌的生长,维持肠道菌群的平衡。本研究利用不需培养计数的RT-PCR的分子生物学方法定量检测了肠道细菌的数量,发现益生菌的添加可以显著降低大肠杆菌的数量,增加乳酸杆菌的数量。但是该方法相当于传统的细菌计数法,不但省时省力,且能有效提高检测的灵敏度,实现快速定量检测。通过比较益生菌组和抗生素组发现,日粮中添加抗生素,在抑制大肠杆菌数量生长的同时也抑制了乳酸杆菌的生长,而益生菌的添加则会促进乳酸杆菌的生长,从这一点来看益生菌组的效果要优于抗生素组。
3.3PCR-DGGE指纹图谱的分析
PCR-DGGE聚类分析的结果和主成分分析的结果一致,益生性屎肠球菌和金霉素的添加并不会影响雏鸡盲肠微生物菌群的正常发育。
Lu等[9]研究发现肉鸡在3~7日龄、14~28日龄及49日龄时的盲肠肠道菌群结构有明显的差异。从本研究的聚类分析和主成分分析结果可以看出,早期肉雏鸡盲肠菌群在7日龄时与在14~42日龄时的差异较大,说明早期雏鸡盲肠菌群从7日龄到14日龄为一个过渡期,从14日龄到42日龄为一个相对稳定期,两者研究结果基本一致。该结果提示,如果在肉雏鸡7日龄之前饲喂有利于盲肠肠道菌群健康生长的益生菌或某种物质,将有利于雏鸡盲肠菌群更有效地达到稳定状态,能减少盲肠菌群在过渡时期给肉雏鸡带来的各种应激反应。
通过比较各处理组相邻周龄之间的PCR-DGGE指纹图谱的相似性指数可以看出,益生菌组在7~14日龄时最低,而在之后均高于对照组和抗生素组,说明在肉雏鸡盲肠微生物菌群的发育过程中,益生菌的添加能更有效地促进肠道微生物菌群进入到稳定状态并且维持稳定。而抗生素组的相似性指数在过渡期7~14日龄要高于其他2组,在之后的稳定期14~35日龄内要低于其他2组,说明抗生素金霉素的添加并没有有效促进盲肠微生物菌群进入稳定状态,反而抑制了微生物菌群进入和维持稳态。
参考文献：
[1]王晓霞,易中华,计成,等.果寡糖和枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道菌群数量、发酵粪中氨气和硫化氢散发量及营养素利用率的影响[J].畜牧兽医学报,2006,37(4):337-341.
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