益生菌作为一种新型绿色饲料添加剂,受到各国研究者的重视,有着良好的发展前景。益生菌是对宿主有益的一类活性微生物,作用于人及动物体肠道和生殖系统等,可改善宿主肠道微生态平衡,发挥有益作用。而乳酸菌作为一类应用广泛的益生菌,是动物肠道中的优势菌群,其无毒、无残留及无抗药性备受关注。植物乳杆菌是一种常见于发酵肉类、蔬菜和果汁中的乳酸菌,是人和动物肠道内的主要菌群,呈革兰阳性杆菌,不形成芽孢、无鞭毛及不运动,过氧化氢酶试验呈阴性,能够产生细菌素等抑菌物质,可抑制革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌的生长,有研究表明饲喂植物乳杆菌可显著地提高仔猪的饲料转化率(P<0.05),并对其日增质量略有提升,还可降低料重比;饲喂植物乳杆菌能够提高动物机体的免疫机能,调节肠道菌群的平衡,从而达到抵抗感染性及过敏性疾病,确保动物健康生长。随着人们对植物乳杆菌的认识的深入及现代生物技术的飞速发展,新型的植物乳杆菌将会进一步发掘,并将广泛应用于今后的食品、医药和饲料添加剂等领域。研究通过从自制泡菜汁中分离获得植物乳杆菌,并鉴定分离获得的菌株,旨在丰富植物乳杆菌菌种库,为植物乳杆菌的研究提供菌种来源。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1分离材料
自制泡菜汁作为分离菌种的材料。
1.1.2菌种
植物乳杆菌购自中科院微生物菌种保藏中心,作为生理生化鉴定中的模式菌株,在MRS培养基上常规培养。
1.1.3供试主要培养基和试剂
MRS培养基,MRS+碳酸钙培养基,LB培养基等;十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)碱和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等细菌DNA提取的试剂为进口,16SrDNAPCR扩展引物F:(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和R:(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')由上海生物工程有限公司合成。dNTP、TaqDNA聚合酶等均购自生物工程(上海)有限公司,其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.4试验仪器见表1
1.2方法
1.2.1植物乳杆菌的分离纯化
取自制泡菜汁,用灭菌氯化钠注射液稀释到10-4倍,取100μL涂布于MRS+碳酸钙培养基平板上,37℃厌氧培养24~48h后,采用四分区划线法,挑取产生溶钙圈且菌落形态疑似植物乳杆菌的菌落形态的菌株,在MRS培养基平板上进行分离纯化培养,经24~48h培养后,挑取分离效果较好的菌株,用接种环接种于斜面上(MRS)进行纯培养,于4℃冰箱保存备用。
1.2.2生理生化鉴定
参照东秀珠的《常见细菌系统鉴定手册》和第八版《伯杰系统鉴定手册》中的植物乳杆菌的生理生化鉴定的试验要求进行鉴定。
1.2.316SrDNA分子鉴定
通过生理生化试验初步筛选出的植物乳杆菌进行基因组DNA鉴定,DNA提取法参照姜云等的方法,采用改良CTAB法提取。通过引物F及R对疑似植物乳杆菌的16SrDNA基因片段进行PCR扩增,PCR扩增体系(25μL)及反应条件见表2,电泳检测PCR产物质量,并回收纯化PCR产物,在中科院微生物所测定疑似植物乳杆菌DNA序列。将所得序列与GenBank中的16SrDNA序列进行BLAST比对,获得相似的序列与系统发育相关的物种,用MEGA4.0软件构建系统发育树进行系统发育分析。
2、结果与分析
2.1细菌的初步分离观察
通过MRS+碳酸钙培养基对泡菜汁进行细菌分离,共获得3株疑似植物乳杆菌的菌株,并将这3株菌分别编号为HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117。以上3株细菌在MRS培养基上用牙签挑起可形成黏液状拉丝,革兰阳性,无芽孢、荚膜及鞭毛,菌体有细长弯曲杆状,排列无序,也有对生,两端顿圆,棒形球杆状。菌株的培养特征及菌体特性见表3。从图1可见:HEW-Z117在加钙MRS培养基上,单个菌落能形成4~10mm溶钙圈。
2.2生理生化鉴定结果
分离获得的3株细菌生理生化鉴定结果见表4,3株菌均可以在10和45℃下生长且氧化酶试验为阳性,精氨酸双水解酶为阴性;其他反应见表4,通过与植物乳杆菌模式菌株比较可初步鉴定HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117为植物乳杆菌。
2.316SrDNA分子鉴定结果
通过CTAB法提取获得菌株HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117的基因组DNA,然后分别对HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117的16SrDNA进行PCR扩增,结果表明,通过PCR扩增获得了菌株HEW-A106、HEW-A111和HEW-A117的16SrDNA片段,片段大小均在1500bp左右,见图2,对获得的16SrDNAPCR产物进行测序,获得菌株HEW-A106、HEW-A111和HEW-A117的16SrDNA序列,大小分别为1425、1467和1434bp。用MEGA4.0构建系统进化树,从图3可见:菌株HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117均与植物乳杆菌聚于同一分支,同源性均达到了99%。通过菌株HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117的形态特征、生理生化反应及16SrDNA特征,鉴定菌株HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117均为植物乳杆菌。
3、讨论
动物肠道是消化道中重要的吸收场所,也是其最大的免疫器官。肠道中存在大量的微生物菌群。
他们协同作用,防止外源病原菌突破这道屏障,以达到维护机体健康的效果。植物乳杆菌是动物肠道菌群的一种共生菌,能够产生乳酸菌素,可有效抑制消化道中的病原菌(大肠杆菌和沙门菌)的生长,维持动物肠道的微生态平衡,从而达到防治疾病的效果,不但解决了抗生素使用所产生的残留问题,而且能够提高动物饲料转化率。研究通过选择培养基从泡菜汁中分离获得了3株疑似植物乳杆菌的菌株,通过形态学鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA分子鉴定发现,3株菌均为植物乳杆菌,即HEW-Z106、HEW-Z111和HEW-Z117。研究获得的植物乳杆菌通过发酵生产并处理加工后,作为饲料添加剂应用于动物,无害、无污染且安全。
目前,国内外对植物乳杆菌的研究已经广泛开展,并取得了一定的成效,欧盟及其他国家也已将植物乳杆菌作为饲料添加剂中微生态制剂菌种的一种。我国是植物乳杆菌等乳酸菌资源比较丰富的国家,对其进一步研究起步较晚。近年来,植物乳杆菌已经引起众多研究人员对乳酸菌、益生素、食品添加剂、饲料添加剂及新药品开发等的研究。植物乳杆菌不仅能够使动物肠道环境偏酸,不利于病原菌生长,而且能够产生抑菌物质,抑制病原菌的侵入。研究仅对分离获得的菌种进行了鉴定,将对其他益生性能做进一步研究,将深入探讨这3株植物乳杆菌的益生性,及其在动物微生态制剂中的应用效果,仍需要动物饲养试验才能确定。
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