免疫应激虽然能够激活免疫系统以抵抗外来病原对机体的损伤,但免疫系统的过度激活会消耗大量能量和营养物质,导致动物生长性能下降,对畜牧业造成一定的损失。因此,抑制或缓解免疫应激对畜牧业有重要意义。传统营养学认为,天冬酰胺(ASN)是一种非必需氨基酸,因而忽略了其在动物营养上的作用。但是有研究结果发现,ASN不但可以刺激肠黏膜细胞增殖,而且还可以增加有氧条件下的新陈代谢,增加产能,在运动条件下缓解疲劳,并且在机体免疫功能方面扮演重要角色。此外,Wu等认为 ASN是一种精氨酸(Arg)家族氨基酸,其在体内可以通过脱氨基和转氨基作用等一系列途径生成 Arg和谷氨酰胺(Gln),而 Arg和 Gln能在调节肠道功能、免疫和炎症方面发挥重要的作用。因此,我们预测 ASN可能也具有重要的生理功能。目前在畜禽研究领域鲜有 ASN的研究报道。本试验通过给仔猪注射大肠杆菌脂多糖(LPS)建立免疫应激模型,以研究 ASN对免疫应激仔猪生长性能、血细胞分类计数和血液生化指标的影响,旨在为 ASN是否参与仔猪免疫应激的调控提供初步的理论依据。
1、 材料与方法
1.1 试验材料
ASN:有效成分 >99.4%,由武汉阿米诺科技有限公司提供。LPS:大肠杆菌血清型 055∶B5,美国 Sigma公司提供,注射时溶解于生理盐水。注射液的 LPS含量为 500μg/mL,按照 0.2mL/kgBW 注射,即100μg/kgBW。
1.2 饲粮组成
基础饲粮配制参照 NRC(1998)猪的营养需要,基础饲粮组成及营养水平见表 1。
1.3 试验动物与设计
选择(21±1)日龄断奶的“杜 ×长 ×大”断奶仔猪 24头,采用单因子试验设计,分为 4个组,每组 6个重复,每个重复 1头猪。4个组分别为:对照组(基础饲粮);LPS组(基础饲粮 +LPS);0.5%ASN组(基础饲粮 +LPS+0.5%ASN);1.0%ASN组(基础饲粮 +LPS+1.0%ASN)。饲粮用丙氨酸进行等氮处理。试验第 16天,分别给 LPS组、0.5% ASN 组 和 1.0% ASN 组 的 猪注射100μg/kgBW的 LPS(0.2mL),对照组注射等量的生理盐水。本试验采用单次注射 LPS建立急性免疫应激模型,LPS的注射次数和剂量参考 Liu等和 Wright等。
1.4 饲养管理
试验在动物营养与饲料科学湖北省重点实验室进 行。舍温保持在25~27℃。猪 栏 面 积1.20m×1.10m。粉料饲喂,自由采食和饮水。按常规程序定期驱虫和免疫。
1.5 样品的采集
试验第 16天,分别于注射 LPS或生理盐水后4和 24h,从仔猪前腔静脉用乙二胺四乙酸(ED?TA)抗凝真空管采血 2mL进行血细胞分类计数。同时,用促凝真空管采血 10mL,静置 15min,3000r/min离心 10min得到血清,分装后 -80℃保存,待测血液生化指标。
1.6 测定指标与方法
1.6.1 生长性能
分别在试验第 1天、第 16天和第 24天清晨将仔猪空腹个体称重和结算饲料消耗,计算试验猪的平均日增重(average daily gain,ADG)、平均日采食量(average daily feedin take,ADFI)和料重比(feed/gain,F/G)。
1.6.2 血细胞分类计数
血细胞含量及其分类计数采用日本 SysmexK-4500血液自动分析仪测定。
1.6.3 血液生化指标
采用日立 -7100全自动生化分析仪测定下列血液生化指标:谷丙转氨酶(glutamic?pyruvictrans?aminase,GPT,酶法)、谷草转氨酶(glutamicoxala?cetictransaminase,GOT,酶法)、谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT,硝基苯酚速率法)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP,连续监测法)活性和肌酐(creatinine,CREA,酶法)、葡萄糖(glucose,GLU,GOD?PAP法)、尿素氮(urea nitrogen,UN,酶偶联速率法)、总蛋白(total protein,TP,双缩脲法)、白蛋白(albumin,ALB,BCG比色法)含量及谷丙转氨酶/谷草转氨酶(GPT/GOT)值。
1.7 统计分析
试验数据采用 SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析(one?wayANOVA)和 LSD多重比较,以 P<0.05为差异显著性标准,以 P<0.10为差异显著性趋势。
2、 结 果
2.1 ASN对 LPS刺激断奶仔猪生长性能的影响
由表 2可知,第 1~15天(应激前),LPS组断奶仔猪的生长性能与其他各组无显著差异(P>0.05)。第 16~24天(应激后),LPS组显著降低了仔猪的平均日采食量和平均日增重(P<0.05),而 0.5%ASN组显著缓解了 LPS刺激导致的仔猪平均日增重的下降(P<0.05)。第 1~24天(全期),LPS组断奶仔猪的生长性能与其他各组无显著差异(P>0.05)。
2.2 ASN对 LPS刺激断奶仔猪血细胞分类计数的影响
由表 3可知,白细胞方面,在 4h时,LPS刺激导致白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞数量显著下降(P<0.05),嗜酸性粒细胞比例显著上升(P<0.05),嗜酸性粒细胞数量和单核细胞比例有下降趋势(P<0.10)。0.5%ASN组显著提高了淋巴细胞和单核细胞比例(P<0.05)。1.0%ASN组显著缓解了 LPS刺激导致的嗜酸性粒细胞比例的上升(P<0.05),对单核细胞比例的降低也有缓解趋势(P<0.10)。在 24h时,LPS刺激导致白细胞数量、嗜中性粒细胞数量及嗜中性粒细胞比例显著上升(P<0.05),淋巴细胞数量、淋巴细胞比例、单核细胞比例显著下降(P<0.05)。
1.0%ASN组显著缓解了 LPS刺激导致的白细胞和嗜中性粒细胞数量的上升(P<0.05)及淋巴细胞数量、淋巴细胞比例的下降(P<0.05),对嗜中性粒细胞比例的上升也有缓解的趋势(P<0.10)。 红细胞和血小板方面,在 4h时,LPS刺激导致血红蛋白含量、红细胞平均血红蛋白和红细胞平均血红蛋白浓度显著上升(P<0.05),血小板数量显著下降(P<0.05)。1.0%ASN组显著缓解了 LPS刺 激导致的血小板数量的降低 (P<0.05)。在 24h时,LPS刺激导致红细胞数量、血红蛋白含量、红细胞压积和血小板数量显著下降(P<0.05)。0.5%ASN组显著缓解了 LPS刺激导致的红细胞数量和红细胞压积的降低(P<0.05)。1.0%ASN组显著缓解了血红蛋白含量和红细胞压积的下降(P<0.05)。
2.3 ASN对 LPS刺激断奶仔猪血液生化指标的影响
由表4可知,在4h时,LPS刺激导致肌酐含量显著上升(P<0.05)。在 24h时,LPS刺激导致谷草转氨酶活性、尿素氮含量显著升高(P<0.05),葡萄糖含量以及 GPT/GOT值显著下降(P<0.05)。0.5%ASN和 1.0%ASN组显著缓解了 LPS刺激导致的谷草转氨酶活性的上升(P<0.05),0.5%ASN组显著提高了葡萄糖含量(P<0.05),对 GPT/GOT值的降低也有缓解的趋势(P<0.10)。1.0%ASN组显著缓解了 LPS刺激导致的 GPT/GOT值降低(P<0.05),对尿素氮含量的上升有缓解的趋势(P<0.10),并显著提高了总蛋白含量(P<0.05),降低了碱性磷酸酶活性(P<0.05)。
3、 讨论
本试验在第 1~15天,ASN对仔猪的生长性能未产生显著影响,这可能与基础饲粮中 ASN足以满足仔猪正常生理状态下的需求有关。而在应激、疾病和感染的情况下,ASN可能通过转化为天冬氨酸(Asp)来合成 Arg,而 Arg又能促进多种内分泌激素(如生长激素、胰岛素、胰高血糖素)的释放,促进蛋白质的合成和抑制蛋白质的分解,从而间接促进动物生长。本试验结果也显示,在第 16~24天,添加 0.5%ASN可缓解 LPS刺激导致的平均日增重下降。这表明在应激情况下,需在基础饲粮中额外添加 ASN以满足机体需要。然而 Wu等报道,Arg添加量过高会对肠道产生负面影响,本试验结果表明,添加 1.0%ASN的平均日增重比添加 0.5%ASN的平均日增重低,这可能是由于高水平的 ASN使断奶仔猪产生过多的内源性 Arg,从而对其肠道产生负面影响,进而影响其消化吸收功能并降低其平均日增重。这表明,饲粮中 ASN的添加量不宜过高。
白细胞俗称白血球,通常称为免疫细胞,在体内担负许多重要功能,它具有吞噬异物并产生抗体的作用,机体伤病的损伤治愈能力,抗御病原体入侵的能力,对疾病的免疫抵抗力等。当机体发生炎症或其他疾病时,白细胞数量及其比例都会发生变化。本试验中,ASN能显著缓解因 LPS导致的白细胞和嗜中性粒细胞数量的上升,显著提高淋巴细胞数量和淋巴细胞比例。Duval等在鼠肿瘤细胞上也得出相似的结论。研究表明,ASN可能在体内通过转化为 Asp,作为合成嘌呤和嘧啶核苷酸的底物,Asp对免疫细胞增殖很重要,ASN还能通过转化为 Asp参与体内的精氨酸 -一氧化氮(Arg?NO)循环,在免疫应激的条件下大量生成一氧化氮(NO),NO能诱发一些保护性因子的产生,同时增强巨噬细胞的活性,增加对内毒素的清除,抑制白细胞和内皮细胞的黏附和浸润,从而减轻炎症反应。
红细胞是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介,同时还能在免疫方面特别是天然免疫和一些特异性免疫方面发挥重要作用。血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
血小板的主要功能是凝血和止血,修补破损的血管。本试验结果表明,添加 0.5%ASN能显著缓解因 LPS刺激导致的红细胞数量的下降,添加1.0%ASN能使受 LPS刺激而降低的血红蛋白数量显著上升,并能显著缓解因 LPS刺激导致的血小板数量的降低,因此,ASN可增强机体的凝血功能并促进红细胞和血红蛋白的生成,从而增加细胞的氧化供能来满足机体的需要。与本试验研究结果类似,Marquezi等在鼠上的研究结果表明,ASN能提高体内的新陈代谢能力以增加能量供给,并在剧烈运动下具有缓解机体疲劳的功能。
白蛋白由肝脏合成,是机体蛋白质来源之一,可用于组织修补和能量供给。血清球蛋白则是源于 B细胞,经转化为浆细胞后分泌形成球蛋白,能反映机体的抵抗力。血清总蛋白则是前两者之和。这 3个指标降低通常是动物发生应激反应的标志之一。尿素氮是机体蛋白质代谢的主要终产物,其含量主要反映机体的代谢能力。葡萄糖是血液中的糖分,葡萄糖必须保持一定的水平,机体的新陈代谢才能正常进行。本试验结果表明,ASN能显著提高血液葡萄糖和总蛋白含量,对血液尿素氮含量的上升也有缓解趋势。ASN可能在体内通过转化为 Asp从而在机体内进入肝脏和肾脏参与无氧代谢,经糖异生作用生成葡萄糖或糖原,提高机体内葡萄糖含量,避免了机体蛋白质降解为生糖氨基酸或其他糖异生的前体物质,从而减少了机体内蛋白质的分解,因此降低了血液尿素氮含量。
血液谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶等活性的升高通常是应激反应的一个标志,同时这 3个指标也是反映肝脏功能的重要指标,其活性升高表示肝脏受到损伤。本试验结果显示,ASN能显著缓解因 LPS刺激所导致的谷草转氨酶活性的升高和 GPT/GOT值的降低,并能显著降低碱性磷酸酶活性。这可能是 ASN在体内通过一系列脱氨基和转氨基作用能转化为 Gln,而 Gln能增加肝脏中蛋白质、DNA和 RNA的合成,并能生成谷胱甘肽来减轻因 LPS刺激而产生的氧自由基对肝脏的损伤,从而起到对肝脏的保护作用。
4 结 论
饲粮中添加 ASN可缓解 LPS导致的仔猪应激,改善仔猪生长性能及机体有关生化免疫指标。饲粮中 ASN的添加量应适当,本试验条件下以 0.5%较适宜,1.0%可产生负面影响。
