17β雌二醇抑制丙泊酚诱导皮质神经元凋亡的机制(2)

　　2 结果。

　　2. 1 Hoechest 33258 荧光染色法检测 17β 雌二醇对丙泊酚诱导皮层神经元凋亡的影响Hoechest 33258 荧光染色法检测皮层神经元凋亡，结果表明溶剂对照组有少量的凋亡细胞呈亮蓝色，凋亡率为（ 6. 7 ± 0. 6） %.与溶剂对照组比较，丙泊酚组神经元凋亡显着性增加（ P < 0. 01） ,大多细胞呈亮蓝色，部分细胞核呈碎片状，部分染色质边集，凋亡率为（ 43. 4 ± 4. 9） %.与丙泊酚组比较，17β 雌二醇 + 丙泊酚组神经元凋亡显着性降低（ P <0. 01） ,凋亡率为（ 22. 1 ±2. 6） %.图1,见彩插 2） .

　　2. 2 TUNEL 法检测 17β 雌二醇对丙泊酚诱导皮层神经元凋亡的影响TUNEL 法检测结果显示： 与溶剂对照组（ 7. 1 ±0. 7） % 比较，丙泊酚组神经元 凋 亡 率 （ 46. 2 ±5. 6） % 显着性增加 （ P < 0. 01 ） ,与丙泊酚组比较，17β 雌二醇 + 丙泊酚组神经元凋亡率 （ 19. 9 ±3. 1） % 显着性降低（ P < 0. 01） （ 图 2,见彩插 2） .

　　2. 3 不同处理对皮层神经元 Bcl-2 和 Bax 蛋白水平的影响与溶剂对照组比较，丙泊酚组 Bcl-2 蛋白水平显着性下降（ P < 0. 01） ,Bax 蛋白水平显着性增加（ P <0. 01） ,Bcl-2/Bax 显着性降低（ P < 0. 01） .与丙泊酚组比较，17β 雌二醇 + 丙泊酚组 Bcl-2 蛋白水平显着性增加（ P < 0. 01） ,Bax 蛋白水平显着性下降（ P < 0. 01） ,Bcl-2/Bax 显着性增加（ P < 0. 01）（ 图 3） .

　　2. 4 不同处理对皮层神经元 cleaved caspase-3 蛋白水平的影响与溶剂对照组比较，丙泊酚组 cleaved caspase-3蛋白水平显着性增加（ P < 0. 01） .与丙泊酚组比较，17β 雌二醇 + 丙泊酚组 cleaved caspase-3 蛋白水平显着性下降（ P <0. 01） .见图 4.

　　3 讨论。

　　全世界每年有数百万儿童由于各种原因需要在全身麻醉下接受手术。丙泊酚作为常用的全身麻醉药，虽然药典显示丙泊酚慎用于 3 岁以下的患儿，但在实际临床工作中，丙泊酚被广泛应用于婴幼儿。丙泊酚是否适用于新生儿和婴幼儿的全身麻醉，目前观点不一。近年来动物和体外细胞研究均表明丙泊酚具有发育期神经毒性，可引起原代培养皮层神经元凋亡和发育期动物大脑神经细胞的大量凋亡并影响动物成年后的学习记忆功能[2 -5].

　　因此丙泊酚在婴幼儿麻醉中的应用引起了学者的广泛关注。针对麻醉药的发育期神经毒性，美国国立卫生研究院、食品药品监督管理局以及国际麻醉研究学会要求研究者寻找有效的措施来防治麻醉药所引起发育期大脑损伤。

　　有关防治丙泊酚引起的发育期大脑损伤的措施近年来进行了一些研究，有研究发现右美托咪定、乙酰左旋肉碱、锂剂等可对丙泊酚引起的发育期大脑损伤产生保护作用[9 -11].神经甾体由脑组织经胆固醇在各种酶的作用下合成的甾类化合物，被称为第四类神经递质，对中枢神经系统的发育和成熟具有重要的影响[12].17β 雌二醇作为一类神经甾体近年来众多学者对其神经保护作用进行了大量的研究，可对多种因素引起的发育期大脑损伤产生保护作用[6 - 8,13,14].但 17β 雌二醇是否对丙泊酚诱导的原代培养皮层神经元凋亡产生保护作用以及机制，未见报道，本文对此进行了研究。

　　目前研究认为凋亡是丙泊酚引起发育期大脑损伤的主要机制[15].荧光显微镜检测法因结果可靠，易于操作而成为检测细胞凋亡的常用手段，尤其适用于体外培养细胞。Hoechst 33258 是一种细胞膜通透性的常见荧光染料，是用于检测细胞凋亡的经典方法。正常细胞核呈圆形，淡蓝色，而凋亡的细胞核呈碎片状，边集的结构特征，由于浓集而使染色增强，荧光更为明亮，呈亮蓝色。本研究采用 Hoechst 33258 染色来观察凋亡的神经元，发现丙泊酚导致神经元凋亡的明显增加，而 17β 雌二醇处理后会使神经元凋亡明显减少。TUNEL 法也称DNA 断裂的原位末端标记法，这一方法能对 DNA分子断裂缺口中的 3'-OH 进行原位标记，借助一种可观测的标记物，对凋亡细胞核 DNA 中产生的 3'-OH 末端进行原位标记，在 DAB 的存在下，产生很强的颜色反应（ 呈深棕色） ,用显微镜即可进行观察，此方法也是用于检测细胞凋亡的经典方法。本实验 TUNEL 结果进一步证实 17β 雌二醇可抑制丙泊酚诱导的皮层神经元凋亡。凋亡发生受促凋亡和抗凋亡两类蛋白的控制。

　　研究表明抗凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白 Bax 蛋白水平高低与凋亡发生密切相关，凋亡的发生由二者的比率决定[16 ,17].Caspase-3 作为凋亡发生的最终执行者，Bcl-2 通过抑制线粒体细胞色素 C 以及caspase-3 的活化产生抗凋亡作用[18].Bax 作为线粒体膜上离子通道的重要组成部分，引起细胞色素C 的大量释放，激活 caspase-9,进一步激活 caspase-3,最终引起细胞凋亡[19].以往研究表明丙泊酚诱导原代培养海马神经元凋亡与丙泊酚下调 Bcl-2 蛋白水平，增加 cleaved caspase-3 蛋白水平有关[3].

　　本研究结果显示丙泊酚诱导皮层神经元凋亡时伴随 Bcl-2 蛋白水平的显着下降，Bax 蛋白水平的显着增加，导致 Bcl-2/Bax 比值显着降低，引起 cleavedcaspase-3 蛋白水平的显着增加。本实验前期研究表明 17β 雌二醇可通过上调 Bcl-2 蛋白水平，下调cleaved caspase-3 蛋白水平，抑制麻醉药氯胺酮诱导的皮层神经元凋亡[7].本研究结果表明 17β 雌二醇预处理抑制了丙泊酚引起的 Bcl-2 蛋白水平的下降和 Bax 蛋白水平的显着增加，使 Bcl-2/Bax 比值显着增加，进而使 cleaved caspase-3 蛋白水平显着下降，抑制了丙泊酚诱导的皮层神经元凋亡。以上结果充分表明 17β 雌二醇抑制丙泊酚诱导的原代培养皮层元凋亡可能与下调 Bax、cleaved caspase-3和上调 Bcl-2 的蛋白表达，升高 Bcl-2/Bax 比值有关，但 17β 雌二醇对其他凋亡相关蛋白是否也有作用以及相关机制，还需要进一步探讨。

　　总之 17β 雌二醇具有保护原代培养皮层神经元免受丙泊酚损伤的作用，其机制是通过抗凋亡作用实现的。本研究为围术期应用 17β 雌二醇预防麻醉药对婴幼儿大脑产生神经损伤提供了初步的实验依据。（图略）

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