关键词： 蛋白质羰基化; 氧化应激; 骨骼肌萎缩; 慢性阻塞性肺病; 癌症恶病质;
慢性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、癌症等老年慢性病患者晚期均可能伴发恶病质,其特征是体重减轻及骨骼肌功能障碍。无论这些老年患者基础的心肺功能如何,其骨骼肌功能障碍和肌肉受损的程度,可以预测患者的死亡率[1]。维持足够的肌肉数量和保持肌肉良好的性能,有助于维持老年患者的日常活动并且提高其生存率。尽管造成老年慢性病患者恶病质发生的原因还未明确,但氧化应激、炎症、低氧、低营养状态、心血管系统功能失调等因素已被证实与其有关。氧化应激是指体内氧化剂增多,导致氧化剂和抗氧化剂不平衡,研究发现其是导致老年COPD患者呼吸肌和肢体肌肉功能障碍的主要原因,也是癌症、败血症、老年患者肌肉功能障碍发生的主要原因[2]。体内氧化剂的增高会改变蛋白质、DNA和脂质等分子的结构和功能,最终导致细胞的损伤和死亡。蛋白质氧化特别是蛋白质羰基化,会使酶活性、转录因子等发生变化,使蛋白质更易发生降解[3]。蛋白质羰基化贯穿于老年慢性病及其并发症发生、发展的始终,在COPD,失用性肌肉萎缩,癌症恶病质,败血症,生理老化等的动物模型中,已得到证实。本文将对蛋白质羰基化在生理、病理状态下的发生机制及检测方法做以综述。
1、 蛋白质羰基化的定义及检测方法
蛋白质羰基化是蛋白质氧化的重要方式之一。其发生机制主要有:①Fenton和Haber-Weiss类型的金属离子催化反应。金属离子催化氧化剂与存在于蛋白质侧链上的赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和苏氨酸之间形成羰基衍生物(醛类和酮),这是机体内最重要的蛋白质氧化的机制。②另一机制是Michael加成反应[4]。此反应是在细胞膜上的多不饱和脂肪酸的过氧化反应期间,由赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸的残基与α、β不饱和醛反应生成的。③蛋白质与活性氧(ROS)直接反应也可能会形成含有高反应性羰基的蛋白质衍生物,或者形成含有高反应性羰基的肽片段。④另外,赖氨酸残基与还原糖或其氧化产物(由糖基化反应或糖氧化反应生成)的二次反应也可能在蛋白质中产生活性羰基[5]。体内长期高水平的蛋白质羰基化会过度激活信号传导通路,加速蛋白质的分解,最终导致细胞死亡。
目前蛋白质羰基化的检测方法:通用的方法是酰肼检测法,酰肼通过席夫醛的形式与蛋白质羰基发生特异性反应,并用氰基硼氢化钠稳定[6]。生物素酰肼常用来标记和鉴定羰基化蛋白质,再通过无凝胶方法及亲和素亲和层析法,最后质谱分析进行直接检测。另外可用稳定的同位素标记法鉴定蛋白质中的羰基,能克服非羰基化蛋白质中抗生物素蛋白(抗生物素蛋白的静电性和疏水性的相互作用)影响实验背景的问题。羰基化验也是量化蛋白质氧化的一个准确、可靠的方法,羰基化验能够检测到反应性羰基与2,4-二硝基苯肼发生化学反应后生成2,4-二硝基苯酚,使用了酶联免疫吸附试验(ELISA)测定,包括免疫印迹和免疫组织化学方法[7]。虽然羰基化验会产生除了蛋白质羰基化以外的其他形式的氧化修饰,但其结果可靠、操作简单方便使其在蛋白质氧化的检测中具有较大的实用价值。
2 、生理状态下的骨骼肌细胞内蛋白质的羰基化
骨骼肌细胞内的氧化剂主要是超氧阴离子(O2-)和一氧化氮(NO)。正常情况下骨骼肌纤维收缩或者舒张时,则产生O2-或NO。在一氧化氮合酶作用下,NO与O2-反应生成活性氧(ROS),触发蛋白质的翻译后修饰,是肌肉细胞产生力量的重要环节[8]。而骨骼肌细胞中的抗氧化剂主要包括存在于肌浆中的铜锌超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和存在于线粒体基质内的锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶。另外,非酶抗氧化系统对抗氧化酶有补充作用,如存在于细胞膜上的脂溶性化合物维生素E,胡萝卜素和泛醇等。ROS在信号通路的调控中可能起到关键作用,它能够使肌肉更快地适应于收缩和舒张。ROS的产生量及产生时间决定了其对组织的影响程度。氧化剂在短时间内适度增加能够激活信号传导通路,使细胞尽快适应环境改变,同时免受压力对肌纤维的进一步的影响[9]。然而当ROS过度增多或抗氧化剂合成减少会过度激活信号传导通路,加速蛋白质的分解,最终导致细胞死亡[10]。
2.1、 衰老导致的蛋白质的羰基化
骨骼肌衰老被定义为随着年龄的增长,肌肉性能的降低和健康指数的下降。衰老的有害影响在老年患者的骨骼肌和神经元等不可再生组织更容易被观察到,因为其损伤或丢失的细胞不能被完整的有丝分裂细胞所替代。蛋白质羰基化是细胞衰老的原因之一。一项针对老年人的研究结果显示:老年人股四头肌中谷胱甘肽的氧化、脂质过氧化、Mn-SOD和过氧化氢酶活性、蛋白质羰基化、DNA氧化等化学反应都有不同程度的增加;其腹直肌中的Mn-SOD活性也显示出更高的活性[11]。老年女性表现出更高水平的总蛋白羰基化和硝化及肋间肌中Mn-SOD含量增高,而老年男性只在四肢肌肉中表现出蛋白加成化合物的增加[12]。另外在一个衰老的动物模型研究发现,骨骼肌数量减少与生长激素、雌激素和雄激素生成减少,葡萄糖、脂肪酸、蛋白质代谢异常,氧化应激增加及体力活动减少等有关[13]。在一项啮齿类动物研究中发现,衰老的膈肌细胞内氧化剂及抗氧化酶含量均会增高[14]。
2.2、 吸烟和蛋白质羰基化
研究发现吸烟人群骨骼肌的蛋白质羰基化水平显着增加。老年长期吸烟者的股四头肌中,糖酵解酶、肌酸激酶、碳酸酐酶-3、ATP-合酶和结构蛋白更容易被羰基化。老年吸烟者与老年非吸烟者相比较,老年长期吸烟者股四头肌的功能显着降低,这说明老年吸烟者肌肉中蛋白质羰基化可能在某种程度上与股四头肌功能降低有关[15]。动物研究发现,长期接触香烟烟雾的豚鼠肌肉中的糖酵解酶、肌酸激酶、碳酸依赖酶-3、ATP合成酶和结构蛋白更易羰基化。长期香烟烟雾暴露可能对暴露动物的所有肌肉产生直接的有害作用。无论动物呼吸系统中是否发现了组织结构的改变,香烟本身可能涉及的直接组织毒性(醛,过氧化物,氮氧化物和过氧化自由基等)都得到了强化。
3 、病理状态下蛋白质羰基化与骨骼肌功能障碍
3.1、 蛋白质羰基化与失用性肌萎缩
长期肌肉废用可致肌肉数量显着损失及肌肉功能的减退,例如在老年患者长期卧床休息的情况下,由于长期固定不动,身体不活动,导致肌肉量的减少和肌肉功能降低。固定肢体的老年动物模型表明肌肉量的减少和肌肉性能的降低是肌肉中蛋白质合成减少和蛋白水解速率增加的结果[16]。ROS水平增加可能与失用性肌肉萎缩的病理生理学相关。目前肌纤维中ROS的来源仍不明确,有几个研究发现在骨骼肌萎缩过程中,黄嘌呤氧化酶和线粒体是诱导ROS产生的主要因素[17]。另外蛋白质羰基化通过激活骨骼肌中的钙蛋白酶,半胱天冬酶-3和泛素-蛋白酶体等蛋白水解系统可能会促进蛋白质分解代谢来加速失用性肌肉萎缩[10]。
3.2 、蛋白质羰基化与老年COPD患者
老年COPD患者骨骼肌功能障碍的特点是肌力和耐力的降低。氧化应激是老年COPD患者(特别是重症患者)的肌肉功能障碍的主要原因。有研究表明,老年COPD患者的血液、呼吸肌和四肢肌肉表现出高水平的脂质过氧化、谷胱甘肽的氧化、蛋白质的羰基化和硝化[18]。过多的ROS诱导减少蛋白质翻译后的修饰和增加骨骼肌纤维内的关键酶和蛋白质的水解。老年COPD患者的局部和全身炎症介质水平都是相对较低的,而在其骨骼肌和血液中,存在较高的氧化应激水平,其肌动蛋白、肌球蛋白重链等结构蛋白和肌酸激酶、碳酸酐酶-3等酶氧化水平增高[19]。另一项研究也发现,严重的老年COPD患者膈肌中蛋白氧化水平更高,并与呼吸肌的功能及气道阻塞程度呈负相关[20]。有研究已经证实翻译后的氧化修饰通常发生在对氧化敏感的蛋白质氨基酸残基中,这可能导致蛋白质功能的丧失,或通过蛋白酶体加速蛋白质降解。
3.3 、蛋白质羰基化与癌症恶病质
癌性恶病质被定义为体重减轻、肌肉萎缩、身体虚弱,并在没有自愿减肥的情况下出现厌食症,通常意味着预后不佳。老年恶病质患者全身肌肉均会受到氧化剂类似物的影响。在几种癌症恶病质的动物模型中,其氧化应激水平升高。在患有肝癌腹水的恶病质大鼠腓肠肌中,氧化应激标志物的水平,如总反应性羰基、蛋白加成化合物、蛋白酪氨酸硝化等显着增高[21]。蛋白质羰基化诱导肌肉蛋白质降解,通过交叉反应机制,减少纤维长度,特别是快收缩肌纤维(Ⅱ型纤维)的长度,最终引发与癌症和其他慢性病相关的恶病质的全身效应。机制可能与Ⅱ型纤维合成的过多的ROS,能诱导周围蛋白质的氧化修饰,使其更易通过蛋白水解系统降解[22]。癌症恶病质的发生打破了氧化还原的平衡,诱导参与肌肉结构和功能的关键蛋白氧化:例如参与糖酵解、ATP产生和分布、二氧化碳水化、肌肉收缩和线粒体代谢的蛋白质均被羰基化。
3.4、 蛋白质羰基化与脓毒血症
脓毒血症是指重症感染的系统反应,临床表现包括如发热、心动过速、呼吸急促、白细胞增多和局部感染等。动物研究表明,患有脓毒血症的大鼠膈肌中蛋白的羰基化和硝化水平是增加的,这表明内毒素血症与呼吸肌力的减少息息相关[23]。在内毒素血症大鼠的膈肌中,检测发现醛缩酶A,甘油醛-3-磷酸脱氢酶和烯醇酶3β,肌酸激酶,碳酸酐酶-3,可收缩的α-肌动蛋白和线粒体泛醇-细胞色素C还原酶等糖酵解酶羰基化水平升高[24]。代谢和血流动力学因素、细菌内毒素、细胞因子、花生四烯酸代谢、一氧化氮和氧化应激等机制参与到脓毒血症引起的呼吸肌功能障碍的发生。细胞分子如兰尼碱受体,肌酸激酶和结构蛋白(肌动蛋白和肌球蛋白)的氧化被列为由脓毒血症诱发的动物实验模型肌肉收缩功能障碍最相关的指标之一。人类研究表明,在严重脓毒血症患者的呼吸和肢体肌肉中同样检测到了蛋白质氧化和硝化水平的升高[25]。脓毒血症患者的股外侧肌蛋白质羰基化水平明显高于对照组,而在呼吸肌肉(肋间外肌)内蛋白质羰基化水平没有差异。总之,这些结果表明关键氨基酸的羰基化,特别是那些位于酶活性位点的氨基酸羰基化后,会干扰酶的活性。
综上蛋白质羰基化能通过诱导关键蛋白质的修饰,改变细胞的结构和代谢,进一步改变肌肉的功能。更重要的是,羰基化的蛋白质可能更容易被骨骼肌纤维中的蛋白水解系统迅速降解,这是组织中蛋白质氧化的重要形式,会增加老年慢性病晚期患者恶病质的发生率。目前对这一领域的研究已经得到很大重视[26]。今后我们研究的方向可能涉及肌肉蛋白质羰基化程度与肌肉功能和数量的降低程度的相关性及对羰基化敏感的细胞内信号转导通路的探讨。为防止老年恶病质的发生和治疗提供新的方法,为老年慢性病的治疗提供新的思路。
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