蛋白甲基转移酶(EZH2)与果蝇zeste 基因增强子同源,是多梳蛋白抑制复合物2(PRC2)蛋白复合物(Ploycmb Repressive Complex 2)的一个催化亚基,通过SET结构域催化组蛋白H3赖氨酸第27号位的三甲基化(H3K27me3),进一步介导转录抑制〔1〕.其在疾病尤其是肿瘤发生发展中的作用已经得到共识,成为当前研究的热点.研究表明,EZH2的过表达在许多不同类型的肿瘤中发现,比如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等,与肿瘤的侵袭、演化以及不良预后有关〔2-5〕.在血液系统肿瘤中,EZH2的过表达已经在成人T细胞白血病/淋巴瘤、Burkitt's淋巴瘤、T/NK细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)等多种淋巴系统肿瘤中被证实〔6-9〕.在神经系统肿瘤中,EZH2与神经胶质瘤,恶性外周神经鞘膜瘤等肿瘤的发生发展、分级及治疗密切相关〔9-10〕.尽管EZH2在神经系统肿瘤中意义重大,EZH2致肿瘤发生的作用机制大部分仍不清楚,目前的国内外基础研究也相当有限.我们成功建立了小鼠胚胎干细胞体外分化体系,观察EZH2在胚胎干细胞诱导分化为神经细胞过程中的蛋白表达变化,为以后对EZH2蛋白功能与作用机制的进一步研究提供依据.
1 材料和方法
1.1实验细胞系 小鼠胚胎干细胞系E14Tg2A.4.
1.2主要试剂、仪器设备及来源 明胶(Millipore,ES-006-B);DMEM 培养基(Dulbecco's minimalessential medium,Specialty media,SLM-220-M);胎牛 血 清(Hyclone,SH30071.03);非 必 需 氨 基 酸(Specialty media,TMS-001-C);2-巯基乙醇(Specialty media,ES-007-E);L-谷氨酰胺(Specialtymedia,TMS-002-C);核苷酸(Specialty media,ES-008-D);青霉素-链霉素(Specialty media,TMS-AB-2C);1 000 U/mL血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF;ESGRO,Millipore ESG1107);胰酶(tryple express Gibco:ref:12605-028,lot:1248224);DMSO(sigma,D2650);DPBS(REF14190144);维甲酸(RA,sigma,R2625-50MG);逆转录酶试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,fermentas);Taq酶,Fast Green Maste(rROX)(04913914001,Roche);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天,P0010S);超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天,P0018);EZH2一抗(BD Biosciences,612666);EZH2 二抗(Abcamab6709);荧光定量PCR仪(CFX96TMReal-Time system C1000,Bio-Rod);ECL化学发光(thermo,Prod#34080);倒置显微镜(Primo Vert,ZEISS);Westernblot所用电泳仪等为Bio-rad公司生产;显影设备为ImageQuant LAS 4000系统.
1.3 RA诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化实验E14Tg2A.4 培养在预铺有明胶涂层的细胞培养皿中,加入 DMEM 完全培养基:80%DMEM 培养基,15%胎牛血清,1%非必需氨基酸,1%2-巯基乙醇,1% L-谷氨酰胺,1% 核苷酸,1% 青霉素-链霉素,1 000 U/mL血病抑制因子.在铺有明胶的10 cm培养皿中,DMEM 完全培养基培养2 d后,收集细胞1.5×106,将细胞沉淀标记为第0天(D0),同时按照1.5×106/10 cm培养皿的密度种植于5个10 cm细胞培养皿,在撤去LIF的DMEM完全培养基中加入维甲酸(浓度为5×10-7mol/L)进行诱导,其间每天换液,第5天诱导结束.于诱导分化第1天(D1)、第2天(D2)、第3天(D3)、第4天(D4)、第5天(D5)收集细胞沉淀,标号.细胞培养期间每天倒置显微镜下观察细胞形态,并拍照保存.
1.4 RT-PCR 在干细胞分化过程中,按固定时间收获细胞,用TRN2ol 试剂提取RNA,然后用SuperScript III逆转录酶,oligo(dT)作为引物合成cDNA,用SYBR green法作定量PCR反应.
1.5 Western blot 将收获的D0至D5细胞沉淀,用RIPA裂解法制备全细胞裂解液,超声破碎,测蛋白浓度,按照 60 μg 的上样量进行 Western blot,用SDS-PAGE蛋白电泳法分离蛋白,用湿转膜的方法把蛋白转移到硝酸纤维素膜上(转膜条件:4 ℃,恒流,360 mA,1 h),3%脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗室温孵育1 h,TBST洗3次,5 min/次,然后二抗孵育1 h,TBST 洗 3 次,5 min/次,ECL 化学发光,孵育5 min,ImageQuant LAS 4000系统显影,应用ImageQuant TL软件分析图像,计算相对蛋白含量.
1.6统计学处理 对各组的计量数据用均数±标准差表示.用SPSS17.0软件统计包进行统计,多组间的比较采用方差分析,总体差异显著后,进行PostHoc两两比较.P<0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1胚胎干细胞诱导分化过程中细胞形态上的变化形态学观察可见,胚胎干细胞(ESCs)呈椭圆或圆形,细胞核大,核仁明显.加入RA诱导1 d后,细胞逐渐变为三角形或多边形向外扩展,随后的几天开始伸出突起,变细变长,与邻近细胞交织成网,在诱导5 d后,形成密集的神经样网络,神经样细胞多呈双极性,胞体圆亮.整体来看,细胞形态已趋于一致.见图1.
2.2 Real-Time PCR验证胚胎干细胞标记物和神经细胞早期分化标记物结果 胚胎干细胞标记Sox2、Oct3/4、Nanong在诱导过程中mRNA表达水平大幅度下降,神经细胞早期分化标记物 Nestin、Tuj1、NeuroD、Nestin在诱导过程中mRNA表达水平大幅度上升.结合从细胞形态学变化和Real-Time PCR分析结果,确定小鼠胚胎干细胞向神经细胞诱导分化成功.见图2~3.
2.3胚胎干细胞向神经细胞分化过程中EZH2蛋白表达水平变化EZH2在小鼠胚胎干细胞中蛋白表达水平比较高(D0).在撤去LIF加入RA诱导向神经干细胞分化1 d后,EZH2表达水平仍然较高.
在RA的持续作用下从第2天开始EZH2表达水平逐渐下降,在第5天降至最低.见图4~5.
3 讨论
本实验成功诱导了小鼠胚胎干细胞向神经细胞的分化,并且观察到EZH2蛋白在小鼠胚胎干细胞中表达水平比较高(第0天),在撤去LIF加入RA诱导向神经胞分化1 d后EZH2表达水平仍然较高,在RA的持续作用下从第2天开始EZH2表达水平逐渐下降,在第5天降至最低的变化.总的来说,本实验建立了小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的体系,观察到与神经发育疾病相关的EZH2蛋白在神经细胞发育过程中的特异性表达变化,为下一步研究EZH2的作用机制打下了基础.
