研究[1-3]表明针刺百会、神庭对改善脑卒中后认知功能障碍 (post stroke cognitive impairment,PSCI)有效. 为探讨针刺治疗 PSCI 的机制,我们用Morris 水 迷宫系统和 TUNEL 检 测法观察电针百会、 神庭穴对缺血再灌注大鼠学习记忆行为的影响.
1 材料与方法
1.1 实 验动物 雄性健康成年清洁级 SD 大 鼠30 只,体质量(275±25)g,福建中医药大学动物实验中心提供,许可证号:SYXK(闽)2005-004.
1.2 材料 28 号 0.5 寸华佗牌不锈钢毫针、华佗牌 SDZ-Ⅱ电针仪(北京瑞康众成科技有限公司);Morris 水 迷宫 ( 中国医学科学院药物研究所 );TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒 (碧云天生物技术研究所).
1.3 大 鼠分组 随机分为 3 组 :假 手术组 、模型组、电针组,每组各 10 只.
1.4 模 型制备 手术组行左侧大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)手术,制备脑缺血再灌注动物模型.
具体方法:10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉成功后,在无菌状态下,切开颈部皮肤,钝性分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(I-CA),结扎 ECA 及 CCA 近心端,远心端穿线备用.
在 CCA 近分叉处剪一小口,插入鱼线进入颈内动脉, 至感觉有少许阻力 (ECA 与 ICA 分叉处约18~22 mm). 然后固定好鱼线 ,尾端留在皮肤外以备抽线, 顺序缝合好肌肉皮肤,2 h 后抽线实现再灌注. 实验过程和动物苏醒期间,注意保温. 假手术组只分离动脉,不结扎、插线. 动物苏醒后通过 Longa 法进行神经行为学评分, 以判断造模是否成功,不合格的大鼠剔除. 以大鼠清醒后爬行时右转圈、提尾时右前肢内收屈曲为入选标准.
1.5 干预措施 电针组取神庭 、百会 ,穴位定位参考《实验针灸学》[4]. 应 用 SDZ-II 电 针仪 ,电压6 V, 以 针体轻轻抖动为度 , 疏密波 , 频率 1~20Hz,每 次 30 min,每 日 1 次 . 手 术后 24 h 开 始治疗, 共 14 d. 模型组与假手术组于手术后回笼饲养,只给予同等条件抓取,不做任何治疗.
1.6 大鼠行为学观察
1.6.1 神经功能评分 造模 2 h 按 Longa 法 进行神经功能缺损评分. 0 分:无神经损伤症状;1 分:不能完全伸展对侧前爪;2 分:外侧(右)转圈;3分:向对侧倾倒;4 分:不能自发行走,意识丧失.分值越高,损伤越严重. 造模后 24 h 评分,以判断造模是否成功. 电针干预后,用于评价电针干预效果.
1.6.2 Morris 水 迷宫实验 水迷宫的水池为 120cm×50 cm×30 cm,水温(26±2)℃. 池壁上 4 个等距离点将水池分为 4 个象限, 池壁外标 4 个入水点, 任选 1 个象限在其中央放置平台, 大小为6cm×28cm,平台没于水面下 2 cm,水池周围参照物保持不变. 2 组大鼠在电针干预后第 7 天进行训练,第 8 天正式开始,持续进行 6 d. Morris 水迷宫包括定位航行实验和空间探索实验 2 个部分.
将受试大鼠按顺时针方向依次由东北、 东南、西南、西北 4 个象限入水点顺序面向池壁放入水中.
如果大鼠在 90 s 内爬上平台,并停留 3 s 以上,则认为大鼠找到平台, 此为逃避潜伏期. 如果 90 s大鼠未能找到平台,则拖拽其尾部,将其引导到平台,熟悉 10 s,此时潜伏期按 90 s 计算. 每次训练间隔为 5 min,计算每一时段 4 个方向潜伏期的平均数及搜索平台所经过的路程. 历时 6 d,每日 1次. 空间探索试验测试大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的能力. 定位航行试验结束后撤出平台,然后任选一相同入水点将大鼠放入水中,测其 90 s 内大鼠穿过原平台区域的次数.
1.7 大鼠脑组织细胞凋亡 TUNEL 检 测 制作石蜡切片,用二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,0.85%NaCl浸洗,浸入 4%多聚甲醛固定 15 min,PBS 浸洗,在每片载玻片上加 100 μL 的 20 μg/mL 蛋白酶 K覆盖组织切片. 室温孵育 10 min,PBS 浸洗 5 min,组织切片洗涤后固定,将样本 PBS 浸洗,室温放置5 min,取出后加 100 μL 平衡液放置 10 min 平衡,加 100 μL TUNEL 反应混合液在标本上, 加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 37℃孵育 60 min,浸入 2×SSC 缓冲液中,室温放置 15 min 终止反应,PBS 浸洗 5 min 重复 3 次, 加 入 50 μLDAPⅠ,避光室温下 10 min, 浸入去离子水中, 室温放置 5min,重复 3 次 ,用玻璃盖玻片及抗荧光淬灭剂封片, 并晾干, 立即在激光共聚焦显微镜下分析样片,用标准的荧光过滤装置在 530 nm 处观察绿色荧光,在 460 nm 处观察蓝色的 DAPⅠ.
1.8 统计学处理 数据用 x±s 和中位数表示,采用 SPSS 17.0 统计分析软件处理,组间比较用 t 检验、单因素方差分析、LSD 法检验,不符合正态分布的用秩和检验,P<0.05 为差异具有统计学意义.
2 结 果
实验结果 见表 1~表5.
3 讨 论
3.1 百 会和神庭为督脉经穴 ,针刺百会 、神庭穴可以直达病所,调整大脑额叶和顶叶的功能,有明显的安神定志、调节情志、醒脑开窍的作用,对神经精神系统的疾患有很好的调整治疗作用. 研究表明中风后患者大脑、 病灶周围有部分细胞处于不完全缺血缺氧状态, 针刺改善这部分细胞的血氧后,可激活这部分组织残留的功能,在一定程度上代偿了因缺血缺氧坏死的大脑细胞的功能[5-6].
本研究结果显示缺血再灌注损伤大鼠脑细胞经过电针百会、神庭穴干预后,不仅可改善神经行为学功能和学习记忆行为, 而且凋亡神经细胞明显减少,说明电针百会、神庭穴具有抗凋亡、保护神经元细胞的作用.
3.2 本 研究结果表明 ,电针百会 、神庭穴可改善中风后认知功能障碍,具有时间累加效应. 提示电针对缺血再灌注损伤大鼠学习记忆行为的作用机制,可能是通过神经元的保护作用而实现的.
参考文献:
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[2] 林 志诚 ,陈立典 ,陶静 ,等. 电针百会穴对脑梗死后认知障碍患者听觉 P300 的影响[J]. 上海针灸杂志,2013,33(1):14-17.
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[4] 余曙光,郭义. 实验针灸学[M]. 北京:人民卫生出版社,2012:252.
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