丁酸对树突状细胞免疫作用的影响(2)

　　1. 7 丁酸对 LPS 刺激的 TLR4 信号通路 ERK 分子磷酸化的影响 将诱导培养 7 d 后的 BMDC,按每孔5×105细胞加入到24 孔板中，分别在0、15、30、60min 时分别加入 LPS 或丁酸盐 （ 终浓度 0. 5 mmol /L） 处理细胞，之后再加入 RIPA 裂解液提取蛋白，Western blot 检测各组中 TLR4 信号通路 ERK 分子的磷酸化。

　　1. 8 统计学分析 实验数据用 GraphPad Prism 5. 0软件分析处理。两组间比较采用 t 检验； 多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用 SNK-q 检验，P<0. 05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 丁酸对 BMDCs 细胞膜表面分子的影响 从图1 可看出，相对于不成熟 BMDCs,LPS 刺激成熟的BMDCs 细胞的膜表面分子 CD80、CD86、MHC Ⅱ、B7-DC 荧光信号强度出现右移，表达上调； 但丁酸处理后可使这些膜表面分子的荧光信号强度又出现左移，表达下调。此结果说明丁酸能够抑制 BMDCs 细胞的成熟。但是，不成熟 BMDCs 组与丁酸盐/不成熟 DC 组间的结果显示，丁酸处理后不成熟 BMDCs细胞表面的 CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC 表达没有明显改变。此结果提示丁酸对于成熟 BMDCs 细胞的表型有明显的抑制效应，而对于不成熟的 BMDCs细胞并无明显影响。

　　2. 2 丁酸对 BMDC 细胞 IL-6、IL-12 和 NO 分泌的影响 不成熟 BMDCs 组与 LPS 刺激成熟 BMDCs 组比较显示，成熟 BMDCs 分泌的细胞因子 IL-6、IL-12（ 图 2A） 和 NO（ 图 2B） 明显增加。但加入丁酸盐处理后，该 BMDCs 细胞对此类细胞因子和 NO 的分泌水平出现明显下降。此结果说明成熟 BMDCs 分泌的 IL-6、IL-12、NO 受到丁酸的抑制。但不成熟 BM-DCs 组与丁酸盐 / 不成熟 BMDCs 组间结果比较显示，BMDCs 分泌的 IL-6、IL-12、NO 并未受到影响，以上结果说明丁酸的处理能够抑制成熟 BMDCs 细胞分泌细胞因子 IL-6、IL-12、NO,而对不成熟 BMDCs细胞并无影响。
　　
　　2. 3 丁酸对 BMDCs 激活抗原特异性 CD8+T 细胞增殖能力的影响 BMDCs 细胞主要的功能之一是激活抗原特异性 T 细胞的活化与增殖。为进一步研究丁酸对 BMDCs 细胞功能的影响，我们将 OVA 抗原特异性 OT1 CD8+T 细胞进行 CFSE 标记后，与 OVA 荷载的 BMDCs 进行共培养，然后分析7-AAD-CD8+T 细胞的CFSE 荧光强度来反映CD8+T 细胞增殖情况。图 3和表3 中的结果显示，体外培养的不成熟 BMDCs 细胞与 LPS 刺激成熟 BMDCs 细胞均可引起 OVA 抗原特异性 CD8+T 的增殖，但成熟 BMDCs 显示出较不成熟 BMDCs 细胞更强的激活 CD8+T 细胞增殖的能力，该组的 CD8+T 细胞增殖分裂甚至可达到第 7 代，其第6 代的 CFSE 荧光信号强度也强于不成熟 BMDCs细胞组。但加入丁酸处理后，成熟 BMDCs 激活的CD8+T 细胞增殖、分裂出现明显抑制。BMDC / LPS /BU 组的 CFSE 荧光强度较 BMDC / LPS 组出现明显右移。此结果说明丁酸的加入使 OVA 抗原特异性CD8+T 细胞的增殖受到明显抑制。而不成熟 BMDCs细胞组与丁酸/不成熟 BMDCs 细胞组的结果显示，两组间 T 细胞的增殖的 CFSE 荧光信号强度最强的都在第4 代，表示主峰都在第4 代； 同时，两组的最高细胞分裂代数可达 6 代，提示丁酸对不成熟 BMDCs 细胞组无明显抑制功能。

　　2. 4 丁酸对 BMDC 细胞 TLR4 信号通路 ERK 分子磷酸化的影响 利用 Western blot 检测 0、15、30、60min 时不同组 BMDCs 细胞 MAPK 通路信 号 分子ERK磷酸化的表达，并结合灰度扫描分析的结果显示： 与不成熟 BMDCs 组相比，受 LPS 刺激成熟的BMDCs 细胞胞内 ERK 分子的磷酸化在 15、30、60min 时间点上均发生上调； 而丁酸处理后，其三个时间点的磷酸化 ERK 的表达均有下降，且以 60 min时下降最为明显，说明丁酸的处理对 LPS 激活的成熟 BMDCs 细胞 MAPK 信号通路 ERK 分子磷酸化有抑制作用。

　　3 讨论

　　众所周知，人体肠道微生物菌群及其代谢产物在维持机体的免疫稳态中起着重要作用。作为肠道微生物的代谢产物之一，丁酸在肠道内呈现出较高的丰度，有文献报道，其小肠中的浓度达到 0. 1mmol / L 到 16 mmol / L,而结肠中的浓度甚至可达到40 mmol / L[9].如此高浓度的丁酸提示着该分子可能是肠道菌群调控机体免疫功能的重要分子之一。

　　有报道认为，丁酸可促进胸腺外调节性 T 细胞（ Tregs） 的分化与产生。该短链脂肪酸可依赖于固有 Foxp3 的增强子即保守非编码序列1（ CNS1） 促进胸腺外，而非胸腺内调节性 T 细胞（ Tregs） 的分化，并且可与 T 细胞相互作用增强 Foxp3 蛋白的乙酰化。也有研究认为，作为组蛋白去乙酰化抑制剂的丁酸在与 DCs 的相互作用中能降低促炎细胞因子的表达，从而加强 Tregs 的诱导[10].丁酸也可通过对组蛋白去乙酰化的抑制下调脂多糖（ LPS） 诱导的巨噬细胞分泌的促炎性介质，调节巨噬细胞的功能[11].本研究结果显示，丁酸能够在体外抑制成熟BMDC 细胞共刺激分子的表达，下调其 IL-12 等细胞因子的表达，并抑制 BMDCs 细胞的抗原提呈功能。

　　树突状细胞（ DCs） 是机体特异性免疫应答的始动者，能诱导初始 T 细胞活化，同时也是体内重要的免疫调节细胞，可通过分泌不同的细胞因子参与固有和适应性免疫应答。来自微生物的病原相关分子 模 式 （ Pathogen associated molecular pattern,PAMPs） 分子，如 LPS 等，能使未成熟的 DCs 细胞获得成熟的表型，上调 MHC 分子和共刺激分子的表达，使 DCs 细胞获得诱导初始 T 细胞活化的能力[12].在正常的机体内，肠道内有着大量正常菌群的定居，其固有的 PAMPs 分子有着潜在的活化体内DC 细胞功能的强大效应。这对于机体的免疫系统是十分危险的，因此，需要有一定的负相调节机制对其进行制约，以维持机体内的免疫稳态。而对肠道区域内 DC 细胞群体及功能的分析也发现，该区域内定居的 DC 细胞对外来的抗原刺激呈现低反应[13,14].考虑到丁酸在肠道内的高丰度存在，并结合其对其他免疫细胞已有的调节作用[10,11],我们推测其对 DC 细胞有负相调控效应，以降低 DC 的反应性，参与机体的免疫稳态。确实，丁酸对于 LPS 刺激成熟的 BMDC 细胞的表型及功能有着明显的抑制效应，显示了其对 DC 细胞的免疫负向调节功能，及其在维持免疫稳态中的潜在重要作用。但有意思的是，该短链脂肪酸分子对于未成熟的 BMDC 细胞的调控作用不明显，提示其可能通过干扰 LPS 介导的模式识别分子信号通路来下调 DC 细胞的功能。

　　已有的研究认为，LPS 通过 TLR4 活化 DC 细胞至少通过两条分子信号通路[15].其中之一是 NF-κB 激活途径，即 LPS 与一系列相关分子作用激活有丝分裂原结合蛋白激酶（ MAPK） 途径，MAPK 被活化后可磷酸化 ERK、JNK、P38 等多种底物，调节相关基因的转录[16].因此本实验选取 MAPK 途径中的 ERK 分子做检测，结果表明丁酸处理之后 LPS 刺激在 BMDCs 细胞中诱导的 ERK 分子的磷酸化确实受到抑制，提示其可能通过干扰 MAPK 通路，从而抑制 LPS 引起的树突状细胞的成熟与功能。但鉴于 TLR4 信号分子通路的复杂性，在此效应中是否还有 MAPK 途径中的其他信号分子或其他通路分子参与； 同时，丁酸对其他 PAMPs 分子介导的信号通路是否也有类似的效应，如 TLR2 通路，还需要进一步研究。