油菜花粉添加富硒酵母对小鼠免疫功能的影响
摘要：目的 探讨添加富硒酵母的油菜花粉对小鼠免疫功能的影响, 以期为制定提高缺硒地区人群免疫功能的措施提供参考。方法 经口灌胃给予昆明小鼠250mg/kg, 500mg/kg, 1 500mg/kg 3个剂量的油菜花粉富硒酵母混合物 (低、中、高剂量组) , 以蒸馏水为对照 (阴性对照组) , 30d后测定小鼠体质量、胸腺质量、脾脏质量、细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性。结果 低、中、高剂量组小鼠脾脏质量/体质量比值和胸腺质量/体质量比值与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。刀豆蛋白A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验结果显示:低、中剂量组光密度差值分别为0.116±0.042及0.123±0.049, 明显高于阴性对照组的0.075±0.031 (P<0.05) 。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果显示:低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数分别为0.377±0.150, 0.539±0.261及0.403±0.113, 均高于阴性对照组的0.203±0.072 (P<0.05) ;低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率分别为 (24.0±6.8) %, (28.6±8.1) %及 (22.6±4.4) %, 均高于阴性对照组的 (15.2±4.2) % (P<0.05) ;低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率平方根反正旋转换值分别为32.4±4.8, 35.7±5.7及31.4±3.4, 均高于阴性对照组的25.4±3.6 (P<0.05) 。低、中、高剂量组小鼠NK细胞活性及其数据转换值与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。结论 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠细胞免疫功能和巨噬细胞的吞噬功能均有增强作用, 可提高小鼠的免疫功能, 因此可以尝试用于免疫功能低下人群尤其是缺硒地区的免疫功能低下人群。
关键词：油菜花粉; 硒; 小鼠; 免疫;
作者简介： 易吉平 (1989-) , 女, 硕士, 医师, E-mail:515180691@qq.com。;
收稿日期：2018-05-09
基金： 湖南省科技厅科研条件创新专项 (2013TT2019);
Effects of rape pollen added with selenium-enriched yeasts on immune functions in mice models
Yi Jiping Cai Tuo Chen Jianfeng Chen Zhilian Xiong Zhijun
Hunan Prevention and Treatment Center for Occupational Diseases
Abstract：Objective To assess the effects of rape pollen added with selenium-enriched yeasts on immune functions in mice models, so as to provide evidence for the development of measures to enhance the immunity of populations in selenium-deficient regions.Methods Kunming mice were orally administered with rape pollen added with selenium-enriched yeasts at doses of 250, 500, and 1 500 mg/kg, respectively (low-, medium-, and highdose groups) , while those control mice were administered with distilled water (negative control group) .At day30, the body mass, thymus weight, spleen weight, cellular immune function, humoral immune function, macrophage phagocytic function, and NK cell activity were measured and compared.Results The spleen weight/body mass ratio and thymus weight/body mass ratio in the low-, medium-, and high-dose groups were similar to those in the negative control group (P>0.05) .ConA-induced mouse spleen lymphocyte transformation test showed that, the optical density values in the low-and medium-dose groups were significantly higher than that in the control group (0.116±0.042 and 0.123±0.049 versus 0.075±0.031, both P<0.05) .According to the mouse peritoneal macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes test, the phagocytic indexes in the low-, medium-, and high-dose groups were significantly higher than that in the control group (0.377±0.150, 0.539±0.261 and0.403±0.113 versus 0.203±0.072, all P<0.05) ;the phagocytic rates in the three dose groups were also significantly higher than that in the control group (24.0%±6.8%, 28.6%±8.1%, 22.6%±4.4% versus 15.2%±4.2%, all P<0.05) ;the square arcsine transformation values of phagocytic rate in the three dose groups were also significantly higher than that in the control group (32.4±4.8, 35.7±5.7 and 31.4±3.4 versus 25.4±3.6, all P<0.05) .Besides, the NK cell activity and its transformation values were comparable among these groups (P>0.05) .Conclusion Rape pollen mixed with selenium-enriched yeasts may improve the cellular immune function and macrophage phagocytic function, and thereby enhance immunity in mice models, which holds some promise for low-immunity populations, particularly those in selenium-deficient regions.
Keyword：Rape pollen; Selenium; Mice; Immunity;
Received： 2018-05-09
油菜花粉是油菜的雄性配子体, 具有低脂肪、高蛋白的特点, 且含有多种维生素、酶、微量元素及小分子化合物等, 其中的黄酮类化合物以及油菜花粉多糖具有抗氧化、清除自由基、抗衰老、护肝、增强免疫力等功效[1,2], 在食品工业以及医药领域具有巨大的潜力。硒是人体必需的微量元素之一, 它可通过硒蛋白参与生物营养、代谢、繁殖、免疫等生理功能。适当补硒, 可以增强人体免疫功能, 预防疾病[3]。酵母硒主要以硒蛋氨酸和硒胱氨酸的形式存在, 为有机硒, 相对无机硒更安全且更易吸收[4,5]。有文献[6,7]报道, 我国不同产地油菜花粉中氨基酸、脂肪酸、矿物质成分含量差别较大, 而在青海省6地区油菜花粉样本中, 有半数地区样本未检出硒元素。本研究欲探讨富硒酵母与油菜花粉的混合物对小鼠免疫功能的影响, 以期为制定提高缺硒地区人群免疫力的措施提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验样品
油菜花粉富硒酵母混合物为黄色粉末, 以油菜花粉、富硒酵母为主要原料加工而成, 由湖南省职业病防治院提供。标志性成分指标:每100g油菜花粉富硒酵母混合物中蛋白质不少于15g, 而每100g油菜花粉富硒酵母混合物中硒 (以Se计) 则为1.65～2.75mg。推荐人体日摄入量为3 000 mg (以每人60kg体质量计算, 折合每日摄入量为50mg/kg) 。
1.2 实验动物
SPF级雌性昆明小鼠, 健康成年, 体质量为18～22g, 共200只。由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供, 实验动物生产许可证号为SCXK (湘) 2013-0004。
1.3 动物饲养
1.3.1 饲料
辐照灭菌清洁级饲料, 由北京科澳协力饲料有限公司提供, 饲料生产许可证号为SCXK (京) 2014-0010。
1.3.2 屏障环境
温度为22～24℃, 湿度为44%～64%。实验动物使用许可证号为SYXK (湘) 2014-0003。
1.4 主要仪器与试剂
超净工作台、CO2培养箱、恒温孵育箱、离心机、酶标仪、723分光光度计、分析天平、电子台称、计时器、血色素吸管、血凝实验板、细胞计数器、玻片架、绵羊红细胞 (SRBC) 、SA缓冲液、Hanks液、生理盐水、RPMI 1640培养基、小牛血清、刀豆蛋白A (ConA) 、噻唑蓝、异丙醇、YAC-1细胞、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑蓝 (INT) 、吩嗪二甲酯硫酸盐 (PMS) 、辅酶Ⅰ (NAD+) 、聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100) 等。
1.5 实验方法
将小鼠随机分为5个大组, 每组40只。分别进行以下实验, Ⅰ组:碳廓清实验, 测定吞噬指数a;Ⅱ组:ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 (MTT法) 及NK细胞活性测定实验, 观察淋巴细胞的增殖能力和NK细胞活性, 测定光密度 (OD) 值;Ⅲ组:脏器质量/体质量比值测定、抗体生成细胞检测 (Jerne改良玻片法) 及血清溶血素测定 (血凝法) , 观察溶血空斑数 (肉眼观察或在显微镜下计数) 和血球凝集程度 (以抗体积数表示) ;Ⅳ组:迟发型变态反应 (DTH) 实验 (SRBC诱导小鼠DTH) , 测量小鼠足跖部厚度差值;Ⅴ组:小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 (滴片法) , 观察小鼠巨噬细胞的吞噬能力, 用吞噬率 (%) 或吞噬指数表示。上述实验依照《保健食品检验与评价技术规范》 (2003年版) 进行操作。
每大组的40只小鼠按体质量随机分为4个小组, 即阴性对照组和低、中、高3个剂量组, 每小组10只小鼠。给予剂量组小鼠油菜花粉富硒酵母混合物 (油菜花粉富硒酵母混合物以蒸馏水混悬, 每天新鲜配制) , 低、中、高3个剂量组小鼠给药剂量分别为250 mg/kg, 500 mg/kg, 1 500 mg/kg;阴性对照组给予蒸馏水。所有动物按20 mL/kg灌胃, 每天1次, 连续灌胃30d。
分别记录给样前及给样结束时的小鼠体质量。实验结束时, 处死小鼠, 取出脾脏和胸腺检测质量, 计算脏器质量/体质量比值。
1.6 统计学方法
采用SPSS 20.0对数据进行统计学分析。统计分析方法包括单因素方差分析、t检验及非参数检验等。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠免疫器官脏器质量/体质量比值的影响
低、中、高剂量组小鼠脾脏质量/体质量比值和胸腺质量/体质量比值与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) (表1) 。
表1 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠免疫器官脏器质量/体质量比值的影响 (±s, %)
2.2 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠细胞免疫功能的影响
小鼠DTH实验结果显示:低、中、高剂量组小鼠足跖部厚度差值与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验结果显示:低、中剂量组OD差值分别为0.116±0.042及0.123±0.049, 明显高于阴性对照组的0.075±0.031, 差异均有统计学意义 (P<0.05) (表2) 。
表2 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠细胞免疫功能的影响 (±s)
a:与阴性对照组比较, P<0.05。
2.3 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠体液免疫功能的影响
抗体生成细胞检测结果显示:低、中、高剂量组小鼠溶血空斑数与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。血清溶血素的测定结果显示:低、中、高剂量组小鼠抗体积数与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) (表3) 。
表3 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠体液免疫功能的影响 (±s)
2.4 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
碳廓清实验结果显示:低、中、高剂量组吞噬指数a与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果显示:低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数分别为0.377±0.150, 0.539±0.261及0.403±0.113, 均高于阴性对照组的0.203±0.072, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率分别为 (24.0±6.8) %, (28.6±8.1) %及 (22.6±4.4) %, 均高于阴性对照组的 (15.2±4.2) %, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率平方根反正旋转换值分别为32.4±4.8, 35.7±5.7及31.4±3.4, 均高于阴性对照组的25.4±3.6, 差异均有统计学意义 (P<0.05) (表4) , 表明低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力增强。
2.5 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠NK细胞活性的影响
低、中、高剂量组小鼠NK细胞活性及其数据转换值与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) (表5) 。
表4 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬功能的影响 (±s)
a:与阴性对照组比较, P<0.05。
表5 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠NK细胞活性的影响 (±s)
3 讨论
蜂花粉中总黄酮含量在0.49%～3.49%之间, 油菜花粉中总黄酮含量在各类花粉中靠前 (平均3.15%) [8]。总黄酮类化合物可通过影响巨噬细胞、T/B淋巴细胞、NK细胞、LAK细胞、细胞因子活性及胸腺功能增强机体的细胞免疫功能和体液免疫功能。其可能的机制主要有以下2个方面: (1) 通过与免疫器官 (胸腺和脾脏) 或免疫细胞的雌激素受体竞争性结合调节免疫功能; (2) 通过调节垂体分泌生长激素和催乳素降低体内生长抑素水平, 间接调节免疫功能[9]。而花粉中的植物多糖增强机体免疫功能主要通过激活巨噬细胞、增强NK细胞和T/B淋巴细胞活性、促进细胞因子分泌、促进抗体生成、激活补体系统、促进红细胞免疫功能及增强网状内皮系统功能等途径实现[10]。杨晓萍等[11]发现, 油菜花粉多糖可通过增强荷瘤鼠脾细胞中白介素-2和肿瘤坏死因子-α的mRNA表达, 刺激荷瘤鼠脾细胞分泌白介素-2和肿瘤坏死因子-α, 进而增强机体免疫, 从而达到抗肿瘤的效果。张金明等[12]通过研究油菜花粉多糖对小鼠免疫功能的影响, 发现油菜花粉多糖能明显增强机体非特异性的细胞免疫和特异性的体液免疫功能, 以及NK细胞的杀伤力。还有研究[13]指出, 油菜花粉中富含的α-亚麻酸可以通过转化、参与激活或抑制某些信号通路, 起到调节免疫的作用。综上可见, 油菜花粉中调节机体免疫功能的主要活性成分可能为黄酮类化合物、多糖类物质以及多不饱和脂肪酸。
通常认为, 硒可以通过促进胸腺、脾脏、腔上囊的淋巴细胞增殖增强机体免疫功能[14]。缺硒可致体内谷胱甘肽过氧化物酶的含量或活性降低, 使机体清除过氧化物能力减弱, 最终自由基增多诱发细胞及体液免疫机制受损。
张荣标等[15]的研究发现, 油菜花粉对雌性BALB/c小鼠NK细胞活性、体液免疫功能、细胞免疫功能均有增强作用, 对小鼠体质量及脏器质量/体质量比值、非特异性免疫功能指标影响轻微。邱美珍等[16]在小鼠饲料中添加0.015%的酵母硒 (有机硒含量2 000mg/kg) , 35d后小鼠抗体生成细胞增殖明显, 血清溶血素水平提高, 单核-巨噬细胞吞噬功能增强, 血清中谷胱甘肽过氧化酶水平升高, 但小鼠的免疫器官质量无明显变化。本研究结果表明, 油菜花粉富硒酵母混合物对各剂量组小鼠体质量及免疫器官质量无明显影响;低、中剂量组小鼠脾淋巴细胞转化能力高于对照组;各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均高于对照组, 与既往研究[15,16]结果一致。
孙丽萍等[17]通过研究油菜蜂花粉及其提取物对小鼠免疫功能的影响, 发现花粉与其部分提取物能增强免疫低下小鼠的碳廓清能力及小鼠网状内皮系统的吞噬能力, 但均对2, 4-二硝基氯苯诱导的小鼠DTH有明显的免疫抑制作用。目前已经证实, 油菜花粉中存在的黄酮类化合物中有一种名为“山奈酚”的物质, 是一种天然的免疫抑制剂, 这或许是油菜花粉及其提取物对小鼠DTH存在免疫抑制作用的原因之一[18,19]。本实验中, 低、中剂量组小鼠足跖部厚度差值低于对照组, 虽差异无统计学意义, 仍可提示低、中剂量的受试样品对小鼠DTH存在抑制。
综上所述, 油菜花粉富硒酵母混合物对小鼠细胞免疫功能和巨噬细胞的吞噬功能均有增强作用, 可提高小鼠的免疫功能, 因此, 可以尝试用于免疫功能低下人群尤其是缺硒地区的免疫功能低下人群。目前, 我国对油菜花粉的开发和利用总体上还处于较低的水平, 对其有效成分的提取、分离和应用仍有很大的空间。现代社会信息交流便捷, 工作与竞争压力日益增大, 相较过去, 人们对营养保健知识的兴趣及对健康的需求日益旺盛[20], 油菜花粉这一古老而又“崭新”的健康资源将会焕发出更大的活力。
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