随着现代口腔种植技术的日益完善,种植义齿修复,在条件允许的情况下,已成为治疗牙列缺损、缺失,恢复口腔咀嚼功能的最佳手段。种植体植入颌骨后与周围骨组织能否形成良好的骨整合( osseointegration) ,以及骨整合形成的快慢、新生骨组织的质和量是影响种植体成功率的重要因素。
目前临床常用的各类纯钛及其合金种植系统通过微螺纹和/或双螺纹的设计、喷砂 - 酸蚀( sand-blasted and acid - etched,SLA) 的表面处理而具有一定的骨传导能力,但无骨诱导性。近年来,学者们尝试通过种植体表面的生物功能化改性技术,将多种调控骨改建过程的细胞生长因子,如骨形态发生蛋白( bone morphogenetic proteins,BMPs)、血小板衍生因子( platelet - derived growth factor,PDGF)和神经生长因子( nerve growth factor,NGF) 等,应用于促进种植体周骨组织再生,获得了诸多成果。
神经生长因子 ( nerve growth factor,NGF) 于1953 年被 Levi - Montalcini 和 Hamburger 首先发现,具有促进神经再生和骨折愈合的双重作用,在改善种植体临床效果方面意义重大。因此,本研究拟通过模拟体液( simulated bodyfluid,SBF) 仿生沉积法,在种植体表面构建钙磷离子/NGF 复合涂层,以期为种植体成功率的进一步提高和远期效果的进一步改善以及新型口腔种植体的开发提供一定的实验依据。
1、 材料与方法
1. 1 种植体的表面处理
本实验所采用的柱状钛合金( Ti6Al4V) 种植体由四川大学国家生物材料工程研究中心提供,表面无螺纹,直径为 1. 0 mm,长度为 12 mm。所有种植体表面均依次进行了如下处理:240、360、600 目砂纸逐级打磨,75 μm TiO2颗粒喷砂,丙酮、乙醇、去离子水 45 ℃ 超声清洗各 30 min后,干燥备用; 63. 6%硫酸、10. 6%盐酸依次 60 ℃水浴各 10 min,去离子水 45 ℃超声清洗 30 min 后,干燥备用; 5 mol/L NaOH 溶液 60 ℃水浴 24 h,去离子水 45 ℃超声清洗 30 min,干燥 24 h 后 600 ℃处理 1 h,无菌条件下储存备用。
1. 2 涂层的制备
无菌条件下,随机选取表面处理后的种植体,置入钙磷离子浓度为正常值5 倍,大鼠 NGF 浓度为10mg / L 的 SBF中( Ca2 +浓度为 2. 5 mmol/L、HPO2 -4浓度为1. 0 mmol/L、pH =7. 40) ,37 ℃水浴,每隔24h 换液一次,48 h 后取出,干燥备用。制备完成后的种植体均在 - 80 ℃ 下避光保存。
1. 3 表面形貌观察
使用 JSM -5900LV 扫描电子显微镜( 电子株式会社,日本; 加速电压 10 kV) 观察在 4 000、100 000放大倍数下 Ca/P/NGF 涂层的表面形貌。
1. 4 涂层厚度及强度检测
1. 4. 1 涂层厚度的检测 种植体( n = 3) 经聚甲基丙烯酸甲脂( poly - methyl - meth - acrylate,PMMA)包埋后,用金刚锯在种植体长轴中点垂直长轴切开,使用扫描电子显微镜检测其横断面涂层厚度均匀区域的多个位点,取其平均值。
1. 4. 2 涂层结合强度的检测 Revetest 使用声发射划痕仪( CSM Instruments,瑞士; 金刚石球状压头直径 0. 2 mm,划痕速度 10 mm/min,加载速率 20N / min) 检测涂层( n = 3) 的临界载荷。每个试件检测 3 次,取其平均值。
1. 5 ELISA 法检测涂层所含 NGF 的总量及体外缓释规律
1. 5. 1 涂层所含 NGF 总量的检测 机械剥离 Ca /P / NGF 涂层,溶解于 1 mL 含 20% 乙二胺四乙酸( ethylenediamineyetraacetic acid,EDTA) 的溶液中,震荡均匀。将适量所获得的 EDTA 溶液稀释 10 倍和 100 倍后进行 NGF 浓度的 ELISA 法检测。
1. 5. 2 涂层体外释出 NGF 量的检测 将 Ca / P /NGF 涂层( n = 6) 种植体置入含有 5 mL PBS 的 10mL 离心管中,37 ℃ 水浴摇床,每隔 1 周换液一次,共 4 周。每次换液前,先使浸入的种植体脱离液面,用洗耳球尽量将种植体上残留的液体吹入离心管中,震荡均匀。将适量所获得 PBS 浸泡液稀释 10倍和 100 倍后进行 NGF 浓度的 ELISA 法检测。
1. 5. 3 NGF 浓度的 ELISA 法检测将 100 μL稀释 10 倍后的样本和 100 μL 稀释 100 倍后的样本加入大鼠神经生长因子 ELISA 试剂盒的96 孔板中,与标准品一起经第一抗体工作液、酶标抗体工作液、底物工作液、终止液反应后,30 min 内用酶标仪测定450 nm 波长处的吸光度。根据标准品绘制的吸光度/浓度曲线,可获得样本中 NGF 的浓度,再乘以体积( 1 mL/5 mL) ,计算得出涂层所含 NGF 的总量以及每 1 周时间段内体外释出 NGF 的量。
1. 5. 4 种植体浸泡液钙磷离子浓度的检测及统一使用实验室离子 + pH 计( IM -55G,DKK - TOA,日本) 检测各周种植体浸泡液中钙磷离子的浓度及pH 值,并取各周等量浸泡液按照 SBF 的配制方法配制等量、Ca2 +浓度为 2. 5 mmol/L、HPO2 -4浓度为1. 0 mmol / L、pH = 7. 40 的溶液。
1. 6 NGF 体外活性测定
1. 6. 1 大鼠骨髓间充质干细胞( bone marrow mes-enchymal stem cells,BMSCs) 的分离、培养、扩增取 4 周龄 SD 大鼠 3 只,断颈处死,无菌条件下分离股骨和胫骨,减去干垢端,DMEM 培养液反复冲洗骨髓腔,获得的细胞悬液以 1 000 r/min 的速度离心10 min,弃掉上清液及杂质,重新悬浮后缓慢加于等体积、密度为 1. 077 g/mL 的细胞分离液之上,避免混合。2 000 r/min 的速度离心 20 min 后,取中间云雾状的细胞层于另一离心管中,PBS 冲洗,按 1 ×109/ L 的密度接种于含 10% ( 体积分数) 胎牛血清的 DMEM 低糖培养基中,置于 37 ℃、5% ( 体积分数) CO2的孵箱中培养,24 h 后首次换液,弃除未贴壁细胞,每隔 3 ~4 d 换液一次。原代细胞( P0) 聚合后,用含 0. 02% EDTA 的2. 5 g / L 的胰蛋白酶消化,按 1∶ 3 的比例进行传代。
1. 6. 2 大鼠 BMSCs 定向成骨细胞分化诱导 将生长良好的第二代大鼠 BMSCs( P2) 消化后,按 1 ×107/ L的密度接种于放有盖玻片的 6 孔培养板,共 24个孔,加入含10%( 体积分数) 胎牛血清、0. 1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β - 甘油磷酸钠、50 μmol/L 维生素 C、100 U/L 双抗的成骨细胞分化培养液,分为 8组,再分别加入等量各周种植体浸泡液配制的溶液( 见1.5.4) 和SBF。将培养板置于37 ℃、5%( 体积分数) CO2的孵箱中培养,每隔 2 ~3 d 换液一次。使用倒置相差显微镜( CKX41,Olympus,日本) 观察 2 周后茜素红染色下钙化结节的形成情况。
1. 7 统计学分析
测定的数据以平均值 ± 标准差的方式表示,使用 SPSS 13. 0 统计学软件包进行 t 检验。P < 0. 05被认为有统计学差异。
2、 结 果
2. 1 涂层的表面形貌
4 000 放大倍数下的涂层表面以成团聚集的微晶为主要特征,凹凸不平,一定程度上增加了材料表面的粗糙度。100 000 放大倍数下的涂层表面以无数纳米级的小球为主要特征,小球粒度约为 200 nm( 图 1 -2) 。
2. 2 涂层的厚度
涂层的平均厚度为( 11. 2 ±0. 26) μm。
2. 3 涂层的结合强度
涂层的平均临界载荷为( 6. 8 ±0. 37) N( 图3) 。
2. 4 涂层的体外缓释规律
本实验使用的大鼠神经生长因子 ELISA 试剂盒,其最小的 NGF 检测浓度小于15 pg/mL。所得的数据见图 4。涂层所含 NGF 的总量为 0. 620 μg,PBS 浸泡 4周后,释出了总量的 79. 03%。
2. 5 涂层释出 NGF 的体外活性
第 2 代大鼠 BMSCs( P2) 定向成骨细胞分化诱导 14 d 后,行茜素红染色,倒置相差显微镜观察( 图5) ,均有钙化结节形成。涂层种植体浸泡液培养孔,钙化结节的平均数目和尺寸均大于同浓度钙磷离子溶液培养孔( P <0. 05) 。
3、 讨 论
最初的 Branemark 种植系统表面光滑,是临床应用最早、随访时间最长的一类种植系统。但随着研究的深入,学者们发现,表面粗糙的种植体具有更好的骨传导性,与周围骨组织的结合更加牢固,远期效果要优于表面光滑的种植体。
骨整合的形成是一个成骨细胞和破骨细胞在相关因子的影响下共同作用的骨改建过程,这些因子主要包括成纤维细胞生长因子( FGFs) ,转化生长因子 - β( TGF - β) 、胰岛素样生长因子( IGFs) 、骨形态发生蛋白( BMPs) 和神经生长因子( NGF) 等。由美国科学家 Puleo 首先提出的种植体表面生物化学改性,就是利用分子生物学和化学方法将多肽、蛋白质及细胞生长因子等生物活性分子复合于种植体表面,构建新一代的分子生物材料,促进有利反应和/或抑制不利反应。能保持生物活性分子复合于种植体表面后的生物活性,是此法最突出的特点。根据所要复合的生物活性分子种类的不同,主要有吸附法、化学键结合法和复合涂层法。
吸附法操作简单,但生物活性分子在种植体表面结合强度低、吸附的总量、密度及分布都无法控制,个体差异也较大; 植入体内后,随体液扩散迅速,其作用与局部注射法类似,作用的部位虽然更直接,但仍难以保持治疗浓度和有效时间。复合涂层法是对吸附法的改良,适用于大多数生物活性分子。它是以模拟体液仿生沉积为基础,生物活性因子通过与钙磷离子共同沉积的方式复合于种植体表面,形成生物活性分子全层均匀分布的钙磷离子涂层。植入体内后,随着钙磷离子涂层表面的缓慢溶解,生物活性分子被逐步释放于周围组织中,具有一定的缓释作用。
制备钙磷离子涂层的方法很多,主要包括等离子喷涂、溶胶 - 凝胶等物理化学方法和模拟体液仿生沉积的生物化学方法。模拟体液仿生沉积的生物化学方法,是通过模拟生理状态下钙磷离子的自然沉积来制备 HA 涂层。与物理化学方法相比,此法在人体正常体温下进行,避免了高温所引起的相变,有利于增强涂层与种植体表面的结合力; 通过控制模拟体液中钙磷离子的浓度,可制得致密的,低结晶度的,具有一定溶解性的涂层; 生物活性分子可以其作为载体复合于种植体表面。
本实验所采用的涂层制备方法是改良后的模拟体液仿生沉积。种植体表面先进行喷砂 - 酸蚀,提高表面的粗糙度和自由能; 再通过碱热处理,形成富含 Ti - OH 的活性表面,种植体表面粗糙度和自由能的提高以及活性的增强都能促进钙磷离子在其表面的沉积。将表面处理后的种植体浸泡入不含 NGF 和含有不同浓度 NGF、钙磷离子浓度为正常值 5 倍的模拟体液中,37 ℃ 水浴 48 h,最终制得的涂层表面以成团聚集的微晶为基础,以无数纳米级的小球为次级结构。
本实验制备的复合涂层的平均厚度为( 11. 2 ±0. 26) μm,平均临界载荷为( 6. 8 ± 0. 37) N。与溶胶 - 凝胶法制备的 HA 涂层相比,本实验制备的涂层厚度是其 10 倍( 0. 955 ±0. 105) μm,临界载荷类似; 而与材料表面未经处理的钛合金试件通过模拟体液两步沉积 72 h 法制备的 HA 涂层相比,本实验制备的涂层厚度是其1/2( 25. 00 ±6. 4) μm,但临界载荷更高( 1. 8 ±0. 08) N。说明模拟体液仿生沉积制备的复合涂层厚度与沉积时间有关; 通过喷砂 - 酸蚀和碱热处理,提高材料表面的粗糙度和表面能,增强材料表面的活性,可以促进钙磷离子的沉积并增强涂层的结合强度。临床植入种植体时的扭矩往往达到 35 N·cm,远高于复合涂层的平均临界载荷。涂层是否会在植入过程中发生脱落是下一步的动物实验需要探明的问题。
本实验制备的涂层种植体含有( 0. 62 ±0. 005)μg NGF,经 PBS 浸泡、37 ℃ 水浴摇床 4 周后,释出了总量的 79. 03%,这说明涂层的体外缓释作用可持续至少 4 周。涂层在第 1 周释出 NGF 的量明显多于后 3 周,这是由于沉积时间结束的时候,涂层表面有部分NGF 分子还未被钙磷离子完全包裹,或是刚刚吸附于已成形的复合涂层表面。浸泡入 PBS 后,这部分结合疏松的 NGF 分子首先脱离涂层表面,从而引起了释出量的激增。而在第 2、3、4 周,两种涂层的NGF 释出量逐渐降低,这与钙磷离子自然沉积形成的 HA 涂层越接近材料表面,结构越致密,溶解性越小的特点是一致的。
有学者观察并检测了 NGF 在种植体早期骨整合中的表达,以组织切片 NGF 免疫组化染色阳性率进行比较,发现种植体植入后,NGF 的表达便开始增加[( 44. 4 ± 3. 7) %],并在第 2、3 周增加到并维持在一个较高的水平 [( 第 2 周: ( 74. 3 ±3. 2) % ; 第 3 周: ( 74. 9 ± 3. 6) % ],第 4 周开始降低[( 31. 1 ± 2. 7) %]。本实验制备的 NGF/HA 复合涂层,其在第 1 周释出量多的特点,正好可以弥补生理状态下骨整合早期 NGF 表达水平相对较低的情况。
虽然尽量模拟了生理环境,但由于没有组织细胞和其他分子的参与,体外实验的规律并不能完全应用于体内。我们推测,NGF/HA 复合涂层在体内释出 NGF 的规律仍存在早期释出量大的特点。与体外相比,由于组织细胞的主动功能活动以及其它分子的参与,涂层降解、释出 NGF 的速度都将加快,缓释时间缩短。
细胞培养的结果显示,成骨诱导 14 d 后茜素红染色下钙化结节的平均数目和尺寸,涂层种植体浸泡液培养孔均大于同浓度钙磷离子溶液培养孔,说明 NGF 的加入可以促进大鼠 BMSCs 的定向成骨细胞分化诱导过程,其促进作用的强弱,在 1 × 107/ L的接种密度下,在 0. 019 ~ 0. 027 μg/mL 的浓度范围内,与浓度呈正相关,涂层种植体第 4 周释出的NGF 仍具有生物活性。
4、 结 论
模拟体液仿生沉积法可在种植体表面成功构具有一定缓释作用的生物活性涂层,其缓释作用可在体外持续 2 周以上,释出的 NGF 能够促进大鼠 BM-SCs 向成骨细胞分化,其促进作用的强弱,在 1 ×107/ L 的接种密度下,在 0. 019 ~ 0. 027 μg / mL 的浓度范围内,与浓度呈正相关,第 4 周释出的 NGF 仍具有生物活性。在下一步的研究工作中,若能明确Ca / P / NGF 复合涂层的最佳沉积条件,提高涂层的结合强度,探明 Ca/P/NGF 复合涂层的体内降解、缓释规律和 NGF 的最佳治疗剂量,理想化的种植体终将出现。
