卵菌纲(Oomycete)是一类类似真菌的真核微生物,包括一些动物或植物性病原菌,植物性病原菌主要包括霜霉目和腐霉目,动物病原菌包括水霉菌株目和水节霉目。卵菌纲病原菌与宿主在长期协同进化过程中,通过分 泌效 应蛋白 (effector pro-teins)到宿主细胞的不同部位来操纵宿主的防卫反应,形成一个对病原感染有利的环境,从而干扰宿主的防御反应。效应蛋白是由病原菌分泌的一类可以改变宿主细胞的结构和代谢途径,从而促进对宿主成功侵染或者触发宿主防卫反应的外泌型蛋白分子,效应因子就是毒力因子。目前对于效应蛋白的研究主要集中于植物病原效应蛋白功能的分子解析,特别是晚疫属及霜霉属的效应蛋白的研究。
这类效应蛋白的生物信息学分析表明它们含有一个高度保守的氨基酸序列RxLR(R代表精氨酸,x表任意氨基酸,L代表亮氨酸)结构域。目前认为卵菌纲病原菌可以分泌几百个效应蛋白分别作用于宿主植物的不同位点。一类是定位于宿主细胞质外体的效应蛋白,由病原菌分泌到宿主植物胞外空间作用于胞外靶标和膜表面受体;另外一类细胞内效应蛋白通过特殊的结构如吸器、侵入泡等结构运输到植物细胞质。
2010年Peter等在寄生水霉中首次发现了一个类似于RXLR结构的效应蛋白,并命名为SpH-tp1(Saprolegnia parasitica host-targeting pro-tein)。通过体外细胞感染实验证实SpHtp1基因在水霉菌株菌的各个生长阶段都存在,并且感染早期高于其他阶段。在感染宿主细胞过程中SpHtp1基因被易位至宿主细胞核中,对水霉成功感染宿主细胞起了重要的作用。目前国外对于SpHtp1基因的研究主要集中在水霉菌株属寄生水霉,而对于其他致病水霉菌株是否含有这种基因仍不确定,笔者通过PCR方法检测SpHtp1基因在我国主要水霉流行区域分离水霉菌中的分布,旨在为进一步分析该基因在感染过程中的具体功能提供理论基础,并为后期从分子以及细胞水平研究水霉感染机制提供理论参考。
1、材料与方法
1.1供试菌株
17株水霉病原菌,分离自全国不同水霉病原采集地(表1),由国家水生动物病原库收集保藏;寄生水霉 菌株ATCC200013TM,购自美国菌种保藏中心。
1.2供试菌株的培养
取保藏于试管中的菌株接种于放有无菌油菜籽粒的PDA平板上,于20℃恒温培养直至油菜籽粒上长满菌丝,然后将长有菌丝的油菜籽转至装有4mL无菌水的6孔板中,于20℃恒温培养。将培养菌丝的6孔板显微观察发现有孢子在游动,直至出现孢子,然后去除菜籽,加入2mL的沙氏葡萄糖液体培养液,4d后即可获得菌丝。
1.3供试菌株的分子鉴定
将菌丝在无菌水中漂洗3~4次后,装入灭菌后的EP管中,然后参照可小丽等的方法对17株水霉菌株病原菌及寄生水霉ATCC200013提取基因组DNA,并对17株水霉菌株进行ITS rDNA序列PCR扩增,PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。将测得菌株的ITS rDNA序列用DNA-MAN软件编辑后,利用NCBI在线BLAST软件与GenBank数据库中已知序列进行同源性比较,并选取同源性较高的序列用MEGA5.0软件构建系统发育树进行系统发育分析,以验证供试菌株分类地位的准确性。
1.4 PCR检测
SpHtp1基因
1)SpHtp1基因的引物设计与合成。以Gen-Bank中已知的寄生水霉SpHtp1基因序列(登录号为:GU345745)作为模板,用Primer premier 5.0软件设计1对特异性引物 (SP-F 5′-GAAAACAA-CAACTCGCAGGAG-3′;SP-R 5′-AGCATTT-GTCGGTACGTCATC-3′),预期扩增片段长度为222bp,引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2)PCR反应。PCR反应条件为:95℃预变性3min,95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸10min;PCR反应体系为:25μL反应体系中含10×PCR Buffer 2.5μL;dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2μL;引物 (10μmol/L)各0.5μL;模板DNA(从寄生水霉ATCC200013中提取的DNA)1μL;TaKaRa Taq(5U/μL)0.125μL;加灭菌蒸馏水至25μL。
3)PCR反应产物电泳、回收、测序。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物用试剂盒[(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extrac-tion Kit)]进行目的片段纯化回收,并连接到pMD18-T载体上、转化到大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆,提取质粒,PCR检测,结果送至上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果通过NCBIBlast软件与GenBank中已知的水霉菌株SpHtp1基因序列进行同源性比对。
4)供试水霉菌株SpHtp1基因的检测。以本文“1.3”中提取的17株水霉菌株的DNA为模板,按照标准菌株ATCC200013TM建立的PCR检测方法进行扩增,产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测该基因在不同种属水霉菌株中的分布,同时将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序。2结果与分析2.1 17株供试水霉菌株的分子鉴定与分析将17株水霉菌株的ITS序列测序结果通过NCBI进行同源性比对,以邻接法构建系统发育树,从分子生物学手段初步判定菌株的种属(表2)。结果显示,Strain Y1与菌株Saprolegnia sp.(JX535255)序列相似性为99%,Strain Y5与菌株Saprolegniasp.(JQ974986)序列相似性为100%。
因此,Strain Y1、Y5隶属于水霉属。
Strain O14与菌株Achlya klebsiana(AF119579)序列相似性为100%,因此为异丝绵霉。
Strain O4与菌株Sapro-legnia australis(AM228826)序列相似性为99%,为南方水霉。
Strain Y2、Y7、O9、O10与菌株Sa-prolegnia parasitica(JN400038)序列相似性为99%,Strain O15、Y4、Y6与菌株Sparolegnia par-asitica(JX213147)相似性为99%,StrainY3与菌株Sparolegnia parasitica(GQ183896)相似性为99%,因此,Y2、Y7、O9、O10、O15、Y4、Y6、Y3为寄生水霉。
Strain O2、O11、Y8与菌株Saprolegniaferaxstrain HS1(JX535250)相似性为99%,StrainO12、O17与 菌 株Saprolegnia ferax strain HP(JN400035)相似性为99%,O2、O11、Y8、O12、O17为多子水霉。
2.2 SpHtp1基因在标准菌株ATCC中的检测用特异性引物对标准菌株ATCC200013TM进行PCR扩增,扩增出一条大小约220bp左右的片段。
经测序,该基因序列与GenBank中已知的寄生水霉SpHtp1(GenBank登录号:GU345745)基因序列的同源性高达99%。说明所扩增的SpHtp1基因特异性片段是正确的。
2.3 17株供试水霉菌株SpHtp1基因检测结果1)电泳分析结果。
PCR产物的电泳结果显示,17株水霉菌株基因组DNA经PCR扩增后,其中8株菌株产生与预期片段大小相吻合的产物,阳性率为47%。另外9株未见任何产物。
2)序列测定、分析结果。随机选取几个阳性对照的PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行克隆测序,并与GenBank中已知的寄生水霉SpHtp1(GenBank登录号:GU345745)基因序列比对,同源性高达99%。说明所扩增的基因即为目的基因。
3、讨论
水霉病是我国大宗淡水鱼类养殖中比较常见疾病之一,鱼体损伤、鱼卵死亡都会造成大规模的水霉病暴发,水霉病的暴发每年给我国水产养殖业造成重大经济损失。由于水霉菌分布范围广,对宿主无选择性,各种淡水鱼类均可感染此病,并且从卵到成鱼各个发育阶段均可感染。自2002年孔雀石绿禁用以后,水霉病的防控成为一个难题。
现阶段国内外对于水霉病的研究主要集中在水霉病的症状的描述、病原菌的鉴定、致病条件的探讨以及防治方法的摸索。关于致病机理的研究还较少,而涉及分子和细胞水平的研究几乎没有。过去对于水霉菌株致病机理主要有2种假说:一种是推测有生命力的胚胎和健康鱼的表皮细胞经常能分泌一种抗霉素粘液来抵抗菌丝夺取其养料,如悬浮在卵间质中的菌丝,因得不到养料就不能继续生长。
另一种是水霉菌株产生的孢子具有趋化性、电极性以及自主性。
SpHtp1基因是目前为止发现的与水霉菌株致病相关的基因。同时证实宿主细胞表面蛋白上存在化学修饰性氨基酸(tyrosine-O-sul-phate)作为病原菌停靠和入侵的分子锚(molecularanchor),SpHtp1就是依靠这种方式进入宿主细胞的。因此,对SpHtp1基因的研究可为进一步研究水霉菌感染机制提供理论基础。
目前关于基因分布的研究方法主要以聚合酶链式反应-限制片段长度多态性(PCR-RFLP)、聚合酶链式 反 应 (PCR)、Southern blot为 主。其 中,以PCR检测较为常见。本试验以17株水霉基因组DNA为模板,PCR检测SpHtp1基因在这些水霉菌株中的分布情况。其中8株水霉菌扩增出了目的基因。结合分子鉴定结果,出现阳性结果的菌株(Y2、Y7、O9、O10、O15、Y4、Y6、Y3),在分类地位上隶属于寄生水霉(Saprolegnia parasitica)。此结果与可小丽等在寄生水霉中发现了该基因存在的结果一致。说明SpHtp1基因在寄生水霉中广泛存在,且对于地域及宿主来源无严格选择性。本试验不仅检测寄生水霉,也检测了其他不同种属的菌株,出现阴性结果的菌株包括异丝绵霉(O14)、多子水霉菌株 (O2、O11、Y8、O12、O17)、南方水霉菌株(O4),以及分类地位上隶属于水霉菌株属的2株菌株(Y1、Y5)。说明,SpHtp1基因在寄生水霉中特异性存在。针对该结果,在未来的研究中可将该基因作为鉴定寄生水霉的一种DNA条形码,为菌株鉴定到种提供参考。而在其他菌株中没能扩增出目的基因片段,说明其他种属菌株可能存在其他与感染相关的基因,而造成这一结果的原因可能是水霉菌株种属间的差异性导致致病机制不同。以往关于水霉SpHtp1基因的研究主要是从mRNA水平,但由于RNA的难提取、易降解等原因,本试验通过提取水霉菌株的DNA成功扩增出了目的基因片段,说明以DNA为模板用PCR法检测SpHtp1基因是可行的、简单的、方便的。
